化学
以蓖麻油作为多元醇原料,通过分步法制备了高性能环境友好的蓖麻油基水性聚氨酯(CWPU),研究了甲基丙酸(DMPA)含量、蓖麻油含量和含量和时,添加n(-OH)/n(-NCO)值达到薄膜的玻璃化转变温度(Tg)、强度和韧性具有显著影响,当蓖麻油含量为41.6℃、65.33MPa制备的7%,107.8%;蓖麻油含量对时,Tg、弹性模量和断裂伸长率分别为个月以上。文中在引入较低的亲水基团含量条件下二羟分散体及薄膜性能的影响。结果表明,DMPA0.99n(-OH)/n(-NCO)值为含量为和317.37%。所有分散体的存储稳定性均在时即可得到半透明泛蓝光的分散体,CWPU分散体能够稳定存在并具有优异的耐水性能和力学性能。分散体,CWPU薄膜的吸水率仅为薄膜的吸水率仅为148.3%;当就可得到奶白色CWPUCWPUDMPADMP
鲫造血器官坏死病是近些年来危害养殖鲫鱼最为严重的传染性疾病,其病原为鲤疱疹病毒II型(Cyprinidherpesvirus2,CyHV-2)。本研究以异育银鲫(Carassiusauratusgibelio)脊髓组织为材料,进行组织细胞体外培养,构建对鲤疱疹病毒II型敏感的异育银鲫脊髓细胞系(SpinalcordtissuecelllinesofCarassiusauratusgibelio,CSC)。采用组织块移植法,进行异育银鲫脊髓细胞的原代培养,并进行传代,已传代至第128代次,获得稳定传代的细胞系后,采用低渗法进行细胞染色体核型分析,并进行鲤疱疹病毒II型的敏感性测试与传代。结果表明,以含10%胎牛血清的L-15培养基,在24°C恒温条件下,可稳定传代培养异育银鲫脊髓细胞,传代细胞呈成纤维样或纺锤状;核型分析显示,染色体数为156±2条,该细胞为三倍体细胞。通过对CyHV-2敏感性的测试,CSC细胞感染CyHV-2后产生典型的细胞病变,感染第7天的病变细胞液的TCID50达到109.33/mL,CyHV-2病毒可在CSC细胞上稳定传代;通过对病变细胞的电镜观察,可见大量直径为128-134nm大小的疱疹样病毒颗粒。以上研究结果表明,本研究构建的异育银鲫脊髓细胞系对CyHV-2敏感,并在细胞上能进行稳定传代,传代病毒具有较高病毒滴度,这为鲤疱疹病毒II型的深入研究及疫苗开发奠定了重要的基础。关键词异育银鲫(Carassiusauratusgibelio);脊髓组织细胞系;鲤疱疹病毒II型中图分类号S943doi:10.11693/hyhz20200300071鲤疱疹病毒Ⅱ型(CyprinidherpesvirusⅡ,CyHV-2)又被称为疱疹病毒性造血器官坏死病病毒(Herpesviralhaematopoieticnecrosisvirus,HVHNV)(徐进等,2013)或金鱼造血器官坏死病毒(Goldfishhaematopoieticnecrosisvirus,GFHNV)(Jefferyetal,2007)与鲤科鱼类的其他两种疱疹病毒CyHV-1(Carppox)和CyHV-3(Koiherpesvirus,KHV)同属于异疱疹病毒科(Alloherpesviridae)鲤疱疹病毒属(Cyprinivirus)。CyHV-2于1992-1993年间给日本西部养殖的金鱼造成了巨大的经济损失,患病金鱼死亡率高达100%(Jungetal,1995)。随后其他国家和地区也相继有了该病暴发的报道,1997年春季在美国西海岸一循环水养殖场的金鱼幼鱼出现大量死亡,死亡率高达80%以上,后经证实其发病是由CyHV-2感染引起的。观赏鱼的国际贸易很大程度上促进了该病的跨区域传播,随后中国台湾、澳大利亚、英国养殖的金鱼相继暴发该病(Stephensetal,2004;Jefferyetal,2007;Hansonetal,2011)。2011年匈牙利报道了养殖的银鲫也发现了CyHV-2感染。而中国大面积暴发该病始于2009年,主要发生在江苏省鲫鱼养殖区射阳、大丰、宝应、高邮、东台等地,发病总面积在6600ha以上,发病严重的塘口死亡率高达90%,造成的经济损失达数亿*浙江省重点研发计划,2019C02058号;浙江省省属科研院所扶持专项,2020YSZX001号。魏钰娟,硕士研究生,E-mail:745722539@qq.com①通信作者:沈锦玉,研究员,E-mail:sjinyu@126.com;潘晓艺,副研究员,E-mail:panxiayi@163.com收稿日期:2020-03-12,收修改稿日期:2020-04-155期魏钰娟等:异育银鲫(Carassiusauratusgibelio)脊髓组织细胞系的建立及对CyHV-2的敏感性1233元(桂建芳,2009;Xuetal,2013)。与此同时,在湖北、湖南、江西、浙江等省份,也相继在患病鲫鱼体内检测出CyHV-2。细胞培养分离技术是病毒病诊断的经典方法,也常被世界动物卫生组织(OIE)所推荐。CyHV-2敏感细胞系的建立对CyHV-2的分离、特征分析和细胞灭活疫苗研究都具有重要作用。但已有研究发现CyHV-2很难在鱼类病毒分离常用的细胞系中进行连续的传代(马杰等,2016),比如胖头鲤细胞(fatheadminnowcells,FHM)(Jungetal,1995)、鲤鱼上皮瘤细胞(epitheliomapapulosumcyprini,EPC)、草鱼卵巢细胞(grasscarpovary,CO)、草鱼肾细胞(grasscarpkidney,CIK)均对CyHV-2不敏感,仅锦鲤鳍细胞(koifin,KF-1)能产生细胞病变效应(CPE),但病毒在KF-1细胞上传至第3-5代后,CPE消失且检测不到病毒核酸(Jungetal,1995)。虽然已有学者建立了异育银鲫脑组织细胞系(Maetal,2015)和鳍条细胞系(Luetal,2018),且对CyHV-2敏感,但由于不对外供应,还是缺乏CyHV-2敏感的细胞系,限制了对CyHV-2的研究,因此建立对CyHV-2敏感的细胞系并研究该细胞系的生物学特性,对CyHV-2进行连续传代扩大培养从而深入研究病毒的特性,具有重要的意义。1材料与方法1.1试验材料患鲫造血器官坏死病异育银鲫(Carassiusauratusgibelio)采集自江苏盐城某鲫鱼养殖场。健康异育银鲫来自于浙江省淡水水产研究所综合试验基地,平均体重120±20g/尾,实验前于室内养殖水池暂养。L-15细胞培养基、青霉素/链霉素、磷酸缓冲液(PBS)、胰蛋白酶-EDTA、秋水仙素均购自Sigma公司,胎牛血清购自GIBICO公司,DNA核酸提取试剂为天根产品;PCR用rTaq预混液购为TaKaRa公司。细胞培养瓶、移液管、细胞冻存管均购自Corning公司。1.2鲫鱼脊髓细胞系的建立1.2.1原代培养健康异育银鲫以75%酒精进行体表消毒3-4次,无菌条件下取出异育银鲫脊髓组织,置于含200U/mL青霉素和200μg/mL链霉素的Hank`s平衡盐溶液(HBSS)中(图1),清洗三次。然后将洗干净的组织移至盛有L-15培养液的培养皿中进行平衡。根据Freshney(2010)和薛庆善(2001)原代培养法,采用组织块移植法进行原代细胞培养。将上述的脊髓组织剪成约0.1mm3的组织块,然后移植到25cm2的细胞培养瓶中,均匀平铺于培养瓶底面,倒置平放,24°C恒温培养,放组织块的一面朝上,培养瓶中添加3mL含20%V/V胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素的L-15培养液,过夜,慢慢将培养瓶正置过来进行培养,每2-3天更换培养液一次,倒置生物显微镜观察细胞生长情况。图1培养皿中异育银鲫脊髓组织Fig.1SpinalcordtissueofC.auratusgibelioinculturedish1.2.2传代培养参照肖艺等(2012)的方法进行细胞传代培养。当细胞从组织块中迁出单层达培养瓶底面积90%时,采用胰蛋白酶消化法按1瓶传2瓶的方式进行传代,24°C培养,待细胞再次形成单层后,再同法进行传代培养,直至获得稳定传代的异育银鲫脊髓组织细胞系CSC。并对稳定传代的细胞系添加细胞冻存液后进行液氮保存。1.2.3细胞染色体核型分析对处于对数生长期的CSC细胞,加入终浓度为0.4μg/mL的秋水仙素,25°C孵育4h后胰酶消化收集细胞,用0.075mol/L的KCl溶液低渗处理25min后加入预冷的卡诺固定液,1000r/min离心5min去上清后再用预冷的卡诺固定液固定3次,每次15min。冷滴片法滴片,干燥后用5%Giemsa染色25min,流水冲洗,干燥后显微镜观察。100倍油镜下随机选取100个细胞,统计其染色体数目。1.3CSC细胞对CyHV-2的敏感性1.3.1对CyHV-2的敏感性将鲤疱疹病毒Ⅱ型阳性的病鱼肾脏、脾脏、脑、脊髓组织剪碎,并加等体积PBS进行匀浆,匀浆液5000r/min4°C离心15min后,上清经0.45μm和0.22μm滤膜过滤,制备成无菌组织匀浆滤液。将病毒滤液按1︰10和1︰20的稀释度感染培养至单层的CSC细胞,24°C吸附1h1234海洋与湖沼51卷后,弃去病毒稀释液,换成血清浓度为2%的L-15维持液继续24°C培养,逐日观察细胞病变情况(Wangetal,2016)。1.3.2病毒的TCID50测定在96孔细胞培养板中将CSC细胞培养至单层细胞,用维持液将CyHV-2感染CSC细胞7d后的病毒裂解液作连续10倍稀释,即10–1、10–2……10–10,每个稀释度取100μL加入96孔细胞培养板中,每个稀释度作8个重复,并设空白细胞培养对照。置24°C培养箱中。逐日观察细胞病变,并记录细胞病变孔数。按Reed-Muench法计算病毒滴度TCID50值。1.3.3CSC对CyHV-2传代的稳定性采用CSC细胞对1.3.1分离的病毒进行传代,传代至第7代次,保存每代次的病变细胞用于CyHV-2的检测。病变细胞的总DNA采用DNAzol进行提取,CyHV-2检测引物为:CyHV-2-366F:5′-GGACTTGCGAAGAGTTTGATTTCTAC-3′;CyHV-2-366R:5′-CCATAGTCACCATCGTCTCATC-3′(Waltzeketal,2009)。1.3.4CSC病变细胞的电镜观察将感染第7代CyHV-2的CSC病变细胞经2%戊二醛固定液(pH7.2,0.1mol/LPBS缓冲液配制)预固定,1%四氧化锇固定液后固定,再经脱水包埋后进行超薄切片,3%醋酸铀-枸橼酸铅双染色后,透射电镜观察。2结果与分析2.1原代细胞特征采用含20%胎牛血清的L-15培养液,对处理成小块的异育银鲫脊髓组织,黏附细胞瓶后,于24°C进行恒温静止培养,3-4d后有些细胞从组织块周围迁出,细胞形态呈成纤维样(图2)。待单层细胞长至充满瓶底面积80%-90%时,按1传2的方式进行传代。图2原代异育银鲫脊髓组织细胞Fig.2ThespinalcordtissuecellsofC.auratusgibeliointheprimaryculture2.2传代细胞特征CSC细胞首次传代,约30min可完成贴壁,群体倍增时间为48h。连续传代8次后,传代细胞贴壁生长速度更趋稳定,3d后可形成单层细胞。在传代至第10代后,逐渐减少血清含量至10%,通过连续传代,采用10%胎牛血清的L-15培养液,24°C培养,可对CSC细胞进行稳定培养,至今CSC细胞已传至128代。获得稳定传代的第10、第50和第100代次CSC细胞形态见图3,并对CSC细胞进行了保藏,保藏号为CCTCCNO:C2018211。采用添加细胞冻存液,将传代的细胞系于液氮中进行冷冻保存。图3异育银鲫脊髓组织细胞系Fig.3MorphologyofCSCcells注:a:10代,b:50代,c:100代2.3传代细胞染色体分析采用秋水仙素使分裂的细胞停止于分裂中期,再通过低渗法进行染色体观察。通过对100个分裂相细胞的观察,第26代异育银鲫脊髓组织来源细胞的染色体数分布在152-160之间(图4a),41%的细胞都含有156条染色体(图4b),表明该细胞的宿主为三倍体异育银鲫。2.4CSC细胞对CyHV-2的敏感性CyHV-2阳性样品组织匀浆液感染CSC细胞单层(图5a),并以含2%血清的L-15维持液培养,逐日观5期魏钰娟等:异育银鲫(Carassiusauratusgibelio)脊髓组织细胞系的建立及对CyHV-2的敏感性1235图4第26代异育银鲫脊髓组织细胞系的染色体Fig.4ChromosomesofCSCcellsatpassage262.6CSC细胞对病毒传代的稳定性对收集的第2-7代次的CyHV-2细胞培养物进行DNA提取,并进行CyHV-2的检测,发现第2代次至第7代次培养物的总DNA,都可扩增得到366bp的目的片段(图6),表明CyHV-2在CSC细胞中可以稳定传代7代以上。图5CSC细胞感染CyHV-2后的病变特征Fig.5CPEfeaturesofCyHV-2infectedCSCcells注:a.感染前正常细胞;b.感染第3天细胞病变;c.感染第5天细胞病变;d.感染第7天细胞病变察细胞病变(CPE),感染后第3天细胞聚合后溶解出现空斑(图5b),感染后第5天空斑区域扩大(图5c),感染后第7天细胞出现大片聚合病变(图5d)。2.5传代病毒的TCID50测定不同稀释浓度的病毒裂解液接种96孔的CSC细胞单层后,连续观察9d,记录每个稀释度的细胞病变孔数,结果见表1所示,按Reed-Muench法计算,换算成1mL所含的TCID50为109.33/mL。图6不同培养代次CyHV-2的PCR检测结果示意图Fig.6SchematicresultsofPCRdetectionofCyHV-2indifferentculturepassages注:M.100bpMarker;1-6.第2-7代CSC细胞培养CyHV-2细胞毒;7.CSC细胞对照;8.阴性对照;9.CyHV-2阳性对照2.7鲤疱疹病毒Ⅱ型感染CSC的电镜观察通过透射电镜观察感染CyHV-2后的CSC病变细胞,可观察到大量直径在128-134nm的疱疹样病毒粒子,呈球形颗粒状。说明CyHV-2在CSC细胞中能繁殖、扩增(图7a,图7b)。表1TCID50检测Tab.1DetectionofTCID50indifferentvirusdilutions3讨论稀释度病变孔数未病变数10–18010–2-10–68010–78010–85310–92610–1008鱼类细胞培养的研究始于20世纪60年代,Wolf等(1962)建立了虹鳟(Oncorhynchusmykiss)生殖腺细胞系RTG-2。此后,鱼类细胞系的建立及其相关研1236海洋与湖沼51卷图7第7代CyHV-2病毒感染CSC的细胞电镜超薄切片示意图Fig.7Schematicviewofultrathinsectionofthe7thgenerationCyHV-2-infectedCSCcells注:a.图中标尺=0.2μm;b.为a图的放大部分,图中标尺=200nm究进展迅速,迄今为止,已有300株左右来自不同品种鱼类的不同组织的细胞系已被建立,鱼类细胞培养已成为一项重要的技术,在病毒学、免疫学、鱼类资源保护与遗传育种、病理学、环境毒理学、鱼类生理学、内分泌学和转基因等方面的理论及应用研究中发挥作用(Lakraetal,2011)。而鲫鱼组织源的细胞系也被多位学者建立,包括鳍条细胞系CFS、鲫鱼异倍体囊胚细胞系CAB-800、鲫鱼腮盖膜细胞系HCC-87、银鲫鱼背鳍细胞系SCC-DF、鲫鱼脑细胞系GiCB、鲫鱼尾鳍细胞系GiCF等(陈敏容等,1985;李亚男等,1992;Hasegawaetal,1997;Maetal,2015;Luetal,2018)。原代细胞培养主要有组织块贴壁法、胰蛋白酶消化法、机械分散法、络合剂分散法等(于淼等,2003)。常用的是组织块贴壁法和胰蛋白酶消化法,比较这两种原代细胞培养法的优缺点,组织块贴壁法更适用于不易消化的组织。根据前期对CyHV-2在鲫鱼内脏组织分布的研究发现,脑和肾脏的病毒含量最高(袁雪梅等,2019),此外,疱疹病毒容易在神经细胞中进行潜伏感染(Grinde,2013),因此,本研究选择与脑连接的脊髓组织作为原代细胞培养的组织源。脊髓组织质地松软,含有较多不易被消化的组织,所以选择组织块贴壁法对鲫鱼脊髓组织进行原代细胞培养。采用胰蛋白酶消化法对鲫鱼脊髓原代细胞进行传代培养,以1︰2的比例顺利获得传代。细胞是否可以长期冻存和成功复苏,对于建立稳定的细胞系至关重要。本实验中,采用液氮保存法,选取了细胞冷冻保护液,有效避免了因细胞在降温过程中形成冰晶而造成的细胞损坏(陈爱平等,2011)。细胞系是分离病毒性病原的重要材料。而鲫鱼来源的对CyHV-2敏感的细胞系较缺乏,制约了有关鲫鱼疱疹病毒病的研究进展。本研究以鲤疱疹病毒Ⅱ型感染CSC细胞系后,细胞出现了明显病变效应,在感染第7天病毒滴度达到了109.33TCID50/mL。而已报道的对CyHV-2最敏感的细胞系,分离的病毒最高滴度只有104.9TCID50/mL(GiCF)(Luetal,2018)和107.5TCID50/mL(GiCB)(Maetal,2015)。这表明CSC细胞系扩增CyHV-2的能力更强,并且分离的CyHV-2病毒可在CSC细胞中稳定传代,传代病毒的各代次病毒滴度稳定。通过对固定的病变细胞进行电镜观察,在细胞中观察到大量的疱疹样病毒颗粒,直径大小为128-134nm,病毒粒子的形状和大小与CyHV-2病毒一致(李茂等,2015)。根据电镜观察到的病毒量,也间接证明了病毒CyHV-2可以在CSC细胞中进行高效的复制。这为制备鲫造血器官坏死病细胞培养灭活疫苗提供了可靠的病毒复制载体。4结论综上,本研究建立的CSC细胞系对CyHV-2敏感,且病毒在该细胞系中能进行稳定高滴度地传代,因此CSC细胞系成为研究CyHV-2复制与发病机制的有效工具,还可用于CyHV-2细胞培养灭活疫苗的制备。以此为基础研究获得的CyHV-2细胞灭活疫苗将有助于我国鲫造血器官坏死病的预防和控制。参考文献于淼,管华诗,郭华荣等,2003.鱼类细胞培养及其应用.海洋科学,27(3):4-8马杰,周勇,范玉顶等,2016.鲤疱疹病毒Ⅱ型的理化及生物学特性和超微形态发生.水产学报,40(3):475-483李茂,肖丹,刘天强等,2015.鲤科疱疹病毒Ⅱ型射阳株5期魏钰娟等:异育银鲫(Carassiusauratusgibelio)脊髓组织细胞系的建立及对CyHV-2的敏感性1237cyprinidherpesvirus2fromgoldfish,Carassiusauratus(L.),intheUK.JournalofFishDiseases,30(11):649-656JungSJ,MiyazakiT,1995.Herpesviralhaematopoieticnecrosisofgoldfish,Carassiusauratus(L.).JournalofFishDiseases,18(3):211-220LakraWS,SwaminathanTR,JoyKP,2011.Development,characterization,conservationandstorageoffishcelllines:areview.FishPhysiologyandBiochemistry,37(1):1-20LuJF,XuD,LuLQ,2018.AnovelcelllineestablishedfromcaudalfintissueofCarassiusauratusgibelioissusceptibletocyprinidherpesvirus2infectionwiththeinductionofapoptosis.VirusResearch,258:19-27MaJ,JiangN,LaPatraSEetal,2015.Establishmentofanovelandhighlypermissivecelllinefortheefficientreplicationofcyprinidherpesvirus2(CyHV-2).VeterinaryMicrobiology,177(3-4):315-325StephensFJ,RaidalSR,JonesB,2004.Haematopoieticnecrosisinagoldfish(Carassiusauratus)associatedwithanagentmorphologicallyherpesvirus.AustralianVeterinaryJournal,82(3):167-169similartoWaltzekTB,KurobeT,GoodwinAEetal,2009.Developmentofapolymerasechainreactionassaytodetectcyprinidherpesvirus2ingoldfish.JournalofAquaticAnimalHealth,21(1):60-67WangH,XuLJ,LuLQ,2016.DetectionofCyprinidherpesvirus2inperipheralbloodcellsofsilvercruciancarp,Carassiusauratusgibelio(Bloch),suggestsitspotentialinviraldiagnosis.JournalofFishDiseases,39(2):155-162WolfK,QuimbyMC,1962.Establishedeurythermiclineoffishcellsinvitro.Science,135(3508):1065-1066XuJ,ZengLB,ZhangHetal,2013.Cyprinidherpesvirus2infectionemergedinculturedgibelcarp,CarassiusauratusgibelioinChina.VeterinaryMicrobiology,166(1-2):138-144的分离与鉴定.淡水渔业,45(3):93-96李亚男,张义,毛树坚,1992.两株鱼类细胞系-草鱼尾鳍组织细胞系(HGC-87)及鲫鱼腮盖膜细胞系(HCC-87)的建立.见:毛树坚.生命科学论文集.杭州:杭州大学出版社,112-119肖艺,曾令兵,徐进等,2012.锦鲤鳍条组织细胞系的建立及其生物学特性.中国细胞生物学学报,34(8):767-774陈爱平,江育林,钱冬等,2011.水生动物疫病病种介绍:传染性造血器官坏死.中国水产,(2):56-57陈敏容,陈宏溪,詠易兰,1985.鲫鱼异倍体细胞系的建立及生物学特性.水产学报,9(2):121-130袁雪梅,潘晓艺,郝贵杰等,2019.一例异育银鲫(Carassiusauratusgibelio)暴发性出血病病原分析.海洋与湖沼,50(4):913-920桂建芳,2009.异育银鲫养殖新品种--“中科3号”简介.科学养鱼,(5):21徐进,曾令兵,杨德国等,2013.鲤疱疹病毒2型武汉株的分离与鉴定.中国水产科学,20(6):1303-1309薛庆善,2001.体外培养的原理与技术.北京:科学出版社,87-101FreshneyRI,2010.CultureofAnimalCells:AManualofBasicTechniqueandSpecializedApplications.6thed.Hoboken:JohnWiley&Sons,IncGrindeB,2013.Herpesviruses:latencyandreactivation-viralstrategiesandhostresponse.JournalofOralMicrobiology,5(1):22766HansonL,DishonA,KotlerM,2011.Herpesvirusesthatinfectfish.Viruses,3(11):2160-2191HasegawaS,NakayasuC,OkamotoNetal,1997.Fincelllinefromisogeneicginbunacruciancarp.InVitroCellular&DevelopmentalBiology-Animal,33(4):232-233JefferyKR,BatemanK,BayleyAetal,2007.Isolationofa1238海洋与湖沼51卷ESTABLISHMENTOFSPINALCORDCELLLINEOFCARASSIUSAURATUSGIBELIOANDITSSENSITIVITYTOCYHV-2WEIYu-Juan1,PANXiao-Yi2,LINLing-Yun2,YAOJia-Yun2,HAOGui-Jie2,CAOZheng2,XIAYan-Chun2,YINWen-Lin2,LIUYi-Han2,SEHNJin-Yu1,2(1.SchoolofFisheriesandLife,ShanghaiOceanUniversity,Shanghai201200,China;2.KeyLaboratoryofHealthyFreshwaterAquaculture,MinistryofAgricultureandRuralAffairs,KeyLaboratoryofFishHealthandNutritionofZhejiangProvince,ZhejiangInstituteofFreshwaterFisheries,Huzhou313001,China)AbstractHemopoieticorgannecrosisofCruciancarp(Carassiusauratusgibelio)isthemostseriousdiseasecausingeconomiclossofCruciancarp.Inthisstudy,thespinalcordtissuecelllineofC.auratusgibelio,namedCSCwasestablishedinvitro.Thespinalcordcellsofcruciancarpwereculturedinprimaryculturebytissueblocktransplantation,andpassedon.Afterobtainingstablecelllines,thecellchromosomekaryotypewasanalyzedbyhypotonicmethod,andthesensitivitytestandpassageofcarpherpesvirustypeIIwerecarriedout.TheresultsshowthattheCSCcouldbestablysubculturedinL-15mediumcontaining10%fetalbovineserumat24°C,andthesubculturecellsaremainlycomposedoffibroblast-likeandspindle-likecells.Karyotypeanalysisshowedthatthenumberofchromosomeswas156±2,andthecellsweretriploid.ThroughthetestofCyHV-2sensitivity,CSCcellsinfectedwithCyHV-2producedtypicalcytopathiceffects.Onthe7thdayofinfection,TCID50ofthecellsinfectedwithCyHV-2reached109.33/mL,andCyHV-2viruscouldbecontinuouslyandstablypassaged.Alargenumberofherpes-likevirusparticleswithadiameterof128-134nminthecellsinfectedwithCyHV-2wereobservedwithelectronmicroscope.ResultsshowthatthespinalcordcelllineofC.auratusgibelioconstructedinthisstudywassensitivetoCyHV-2andcouldbestablysubcultured.Thesubculturevirusshowedahighvirustiter,whichlaysanimportantfoundationforthefurtherresearchandvaccinedevelopmentagainstCyprinidherpesvirus2.KeywordsCarassiusauratusgibelio;spinalcordtissuecellline;CyHV-2
在pH=7.40生理条件下,盐酸赛庚啶(CH)对牛血清白蛋白(BSA)的荧光强度具有明显的猝灭作用。在25mL比色管中,加入一定量的Tris-HCl缓冲溶液、BSA和CH,用水稀释至刻度,选择20、30和37℃恒温0.5h后,扫描其荧光光谱和同步荧光光谱。求得了CH-BSA的表观结合常数(KA(20℃)=0.46×105,KA(30℃)=3.14×105,KA(37℃)=1.16×105),结合位点数n≈1。由所得热力学常数确定了CH-BSA以疏水作用力为主结合。评估了共存AuNP对CH-BSA作用的影响,其结合常数降低一个数量级,结合位点数也有所降低。根据Frster偶极-偶极无辐射能量转移理论,求得了CH-BSA的结合距离(r)=5.07nm和能量转移效率E=0.0157。此外,应用紫外吸收光谱法研究了CH-BSA的作用机理。
无摘要
氧化钆纳米材料因其具备独特的光学性质与磁学性质,在发光材料、生物标记、生物成像和温度传感器等领域备受关注。为了进一步满足发光材料及生物医学领域对多功能纳米材料的需求,稀土离子及金属离子掺杂的钆基纳米材料应运而生,这种新型的纳米发光材料克服了传统荧光材料发光强度不稳定、检测灵敏度低、生物毒性高的缺点;基于近年来国内外稀土离子和金属离子掺杂纳米氧化钆的研究和现状,综述了不同离子掺杂的氧化钆纳米颗粒在发光材料及医学造影剂方面的应用,在此基础上介绍了提高氧化钆纳米颗粒发光强度、驰豫性能的途径。
为研究空心梯形台人工鱼礁体布设间距的变化对其水动力特性的影响,通过物模实验实测了开口比为0.1的梯形台人工鱼礁体在平行水流方向布设间距为1.0L、2.0L、3.0L(L为礁体的底边边长),前后共6个测点的流速及礁体受力。分析得到了双礁体的上升流规模、阻力系数在平行和垂直水流方向随布设间距变化的规律。采用计算流体动力学(ComputationalFluidDynamics,CFD)方法模拟了双礁体分别在垂直水流方向布设间距为0.5L、1.0L、1.5L、2.0L,平行水流方向布设间距为0.5L、1.0L、2.0L、3.0L、4.0L时的水动力场。结果表明:本研究数模与物模相同工况下,即双礁体在平行水流方向布设间距1.0L、2.0L、3.0L时,数值模拟的流速值和阻力值与相应的实验结果吻合较好,说明数值模拟方法可行,结果可靠。数值模拟结果得到双礁体的上升流规模、阻力系数均与垂直水流方向布设间距成反比。当垂直水流方向布设间距为0.5L时,流场效应最佳;双礁体的上升流规模随平行水流方向布设间距成正比,前方礁体阻力系数变化幅度较小,后方礁体阻力系数逐渐增大;当平行水流
摘要基于波长色散型X射线荧光光谱仪,采用液体杯制样并运用QuantExpress无标样分析软件,测定环烷酸钼、环烷酸镍中Mo、Ni的含量,并考察了灰化温度参数、支撑膜对环烷酸钼、环烷酸镍样品中Mo、Ni的含量的影响。环烷酸钼、环烷酸镍中Mo、Ni的检出限分别为2.6PPM与4.3PPM,试验测量值与标准值相对误差低于5%、相对标准偏差低于4%(n=6),结果证明,方法无需标样且测量结果具有高准确度和高可靠性、简便快速等优点。
随着家用电器的普及和磁场在现代医学的广泛应用,人类暴露于磁场的风险逐渐增大,磁场对人类健康与生态环境的影响已引起公众的日益关注。稳态磁场(staticmagneticfields,SMFs)具有磁场强度及方向不随时间而发生变化的特性,而各种强度的稳态磁场实验装置陆续建成,为相关磁场生物学效应研究提供了重要实验平台。秀丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegans)是一种应用广泛的模式生物,能灵敏感知磁场变化。本文结合近年来国内外稳态磁场装置的发展相关研究进展,综述了不同强度的稳态磁场对于秀丽隐杆线虫的生物学效应,主要涉及生长发育、老化、运动行为、应激和代谢等,以及其响应机制,并总结归纳了不同强度稳态磁场条件下秀丽隐杆线虫的生物磁效应的异同点,以期为稳态磁场的医疗应用以及各种暴露限量标准的制定提供理论参考。
以油茶果壳与再生纤维为原料,采用添加微量有机抑菌剂的方法,研制具有抑菌功能的油茶果壳基复合纸,探讨油茶果壳含量、油茶果壳目数、抑菌剂添加方式对纸性能的影响,并测试了复合纸的拉伸强度、蠕变性以及抑菌性能。结果表明,当油茶果壳含量为10%,粒径大小为60~80目,抑菌剂采用葡萄糖酸洗必泰,添加方式为喷涂交联法时所制备的复合纸的各项性能最佳,其中油茶果壳基抑菌纸的定量为200g/m2,厚度为1mm时,拉伸强度为2.54MPa,应变恢复为59.7%,对大肠杆菌与金黄色葡萄球菌的抑菌圈均为12mm。
采用两步法制备ZnO/聚噻吩(ZnO/PTh)复合材料,首先制备富含氧空位缺陷的ZnO,然后以此为载体,通过噻吩单体的原位聚合得到最终产物。通过X射线衍射、场发射扫描电镜、高分辨透射电镜、红外光谱、紫外-可见漫反射光谱和荧光光谱对合成材料进行表征,研究了其紫外激发室温气敏性能,分析了紫外激发气敏机理。结果表明:紫外光激发下复合材料室温下对乙醇有较高的灵敏度,对100×10-6乙醇的灵敏度达到12.6,响应和恢复时间均在40s以内。
无摘要
采用密度泛函光学性质的调控。通过与实验合成的分子对比,揭示苯胺基团取代位置和数量对电子结构和光学性质的调控规律。引入苯胺基团可有效地增大金属和配体的π共轭性。逐渐增多苯胺基团导致M3分子可以有效地增大吸收光谱的强度和金属到配体的电荷转移占比,(3LLCT)有利于金属对光的吸收和自旋轨道耦合。M1和配体之间的电荷转移T的研究,发现当二苯胺取代基团引入位置可能量变得更高,从而抑制了非辐射的概率,有利于发光性能(3MLCT)→TS→S0和M3的发射峰在MECP602~630nm3MC(,发射光谱归属为金属中心三重态1的系间交叉(MLCT)3MLCT配合物T~⁃)dd。通过对非辐射跃迁过程,即1以有效地增大分子内空间位阻时,形成提高。O614.82+6
无摘要
运动发酵单胞菌通过ED途径高效转化单糖生成乙醇,其生长不需氧气,能够以N2作为氮源,抗逆性强;其乙醇发酵速度快,乙醇理论产率高,生产周期较短和原料利用率较高,容易迚行基因工程改造。本文采用水稻和木薯为乙醇发酵的原料,研究重组运动发酵单胞菌的发酵特点,验证其乙醇发酵性能,为其今后在乙醇生产中实际使用积累经验和提供参考依据。本实验结果证明,与安琪超级酿酒干酵母相比,在重组运动发酵单胞菌的乙醇发酵过程中,CO2产量更低导致发酵失重更少,乙醇产量明显增加,最佳发酵温度更高,淀粉出酒率更高和淀粉利用率更高。重组运动发酵单胞菌对安菌泰和青霉素有较强的耐受性,乙醇发酵指数期大约为0~40h,种子扩大培养期间不需要添加任何外来氮源。关键词:运动发酵单胞菌;乙醇发酵;水稻;木薯
以2-氯代三苯甲基氯树脂为载体,采用Fmoc/t-Bu/Dmab正交保护策略,在微波辅助下合成了环肽c(fKRGD),收率22.5%,纯度94.5%,其结构经MS(ESI),MS(MALDI-TOF)和HPLC确证。
建立一次性使用高压造影注射器及附件中粘合剂环己酮和增塑剂乙酰柠檬酸三丁酯迁移量的气相色谱–质谱检测方法。选择两种造影剂,模拟临床使用条件,经高压造影注射器推注后用正己烷萃取,用气相色谱–质谱法对其中的环己酮和乙酰柠檬酸三丁酯进行定量分析。结果表明,环己酮和乙酰柠檬酸三丁酯的质量浓度分别在0.151~0.906μg/mL和0.0475~0.4750μg/mL范围内线性关系良好(r≥0.9994),样品测定结果的相对标准偏差为1.0%~3.6%(n=6),加标回收率分别为92.3%~103.9%,67.6%~89.7%。该方法简单、快速、准确,可用于高压造影注射器中环己酮和乙酰柠檬酸三丁酯迁移量的测定。
放射性洗消一直是洗消技术研究的难点,传统的高压水冲洗、化学试剂浸泡、喷砂等洗消方法具有破坏年来可剥离膜在放射性洗消中的研究进展,重点聚焦改进可剥离膜性,同时产生大量的二次污染物。综述了近性能、改进去污效果和新型膜材料这方面的研究热点。分析已有的研究数据,发现虽然可剥离膜去除松散的放射性表面污染是一种很有效的方法,然而大多数相关研究缺乏标准详细的操作规程和定量的数据来评估或比较实验的有效性。203
以葛根素为起始原料,经醚化反应制备中间体(3-[分别经胺化反应合成葛根素衍生物4'-O-(),其结构经1HNMR、13CNMR、HR-MS和34根素(抗缺氧实验对葛根素及分别为关键词:葛根素衍生物;合成;构象异构;抗缺氧活性
辐射技术以其环境友好、操作简单、对基材损害小等优点,逐渐得到了人们的广泛关注。利用电离辐射诱导聚合物发生交联、降解和接枝的方法已广泛应用于高分子材料的改性研究中。聚酯是一类性能优异、用途广泛的材料,在材料领域占据重要地位。主要概述了辐射(高能电子束、γ射线、紫外光等)对聚丙交酯(PLA)、聚己内酯(PCL)和聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)等聚酯材料物理化学性能的影响,分析并总结了辐射改性聚合物的原理和方法。
通过测定发泡剂在固定体积的密闭容器下的发气气体的压力变化,可以计算得到发泡剂的发气量,同时也可以通过测定固定体积的密闭容器内发气的气体压力,得到发泡剂的起发温度、突跃温度、终止温度、最高发气量等参数,从而可以监控发泡剂发气的整个过程。建立了固定体积密闭容器下的气体压力与发泡剂的发气体积之间的函数关系式,可以将固定体积密闭容器下测定的发泡剂的发气气体压力转换成排水集气法测定的发泡剂的发气量;也可以将排水集气法测定的发泡剂的发气量曲线(随温度变化),转变为密闭容器下压力曲线(随温度变化);并选取偶氮二甲酰胺(ADC)进行试验,验证了公式的可行性。关键词:发泡剂;发气量;发气气体压力;固定体积