EEA1慢病毒表达载体的构建及其对查菲埃立克体感染细胞的影响
【摘要】 目的利用分子生物学方法构建早期内吞体相关蛋白1（EEA1）慢病毒载体，并感染犬的巨噬细胞DH82，建立稳定表达EEA1的DH82细胞系。方法将聚合酶链反应（PCR）扩增得到的EEA1和慢病毒载体GV287双酶切后连接，构建慢病毒表达载体GV287-EEA1，经酶切、测序鉴定重组质粒。将重组载体与包装系统pHelper1.0、pHelper2.0质粒共转染293T细胞，包装慢病毒并测定滴度。将构建好的慢病毒表达载体感染DH82细胞，通过实时荧光定量PCR（qPCR）和Westernblot检测DH82细胞中EEA1的过表达情况。进一步利用查菲埃立克体感染稳定表达EEA1的DH82细胞。结果GV287-EEA1经双酶切分析和测序，证实插入序列正确，成功构建慢病毒表达质粒，并成功包装成慢病毒，病毒滴度为1×109TU/mL;病毒液有效感染DH82细胞，依据GFP绿色荧光可检测感染率达80%以上;qPCR和
