外泌体与Wnt3a联合诱导间充质干细胞归巢及定向分化
【摘要】 目的观察外泌体（exosome）联合Wnt3a蛋白刺激机体内源性干细胞归巢并定向分化后促进大鼠皮肤软组Wnt3a及组中及BMSCsVEGFBMSCsqRT-PCRqRT-PCRWesternblot方法观察外泌体联合蛋蛋Wnt3aWnt3a蛋白作用于间Wnt3a常规提取大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）来源外泌体，将外泌体联合织缺损修复的过程。方法充质干细胞，运用白在体外对白，采用免疫荧光染色、Westernblot归巢效应，并对创面愈合率进行分析，以观察该联合方案对组织创面的修复效果。结果照组方法检测血管形成相关细胞表面标志物的表达，明确外泌体联合的诱导分化作用。随后，制作大鼠大面积皮肤软组织缺损模型，组织创面注射外泌体和比较，Exosome+Wnt3a和刺激机体内源性干细胞后产生的干细胞检测结果显示，与对NG2、血管内皮细胞标表达均升高，证实产生分化。在大鼠大面积皮肤天愈合率达（93.05±2.72）%，明显高于其它组（P<组在术后第天的评分高于假手术组（P<0.01），而天出现了大量的新生血管，与假手术组比较差异有统计学意义[（48.260±1.821）个/mm2vs.（8.484±1.291）个/治疗后明显多于假手术组志物软组织缺损模型中，Exosome+Wnt3a160.01）。肉芽组织和伤口成熟度评分结果显示，Exosome+Wnt3a且第mm2，P<0.01]。免疫荧光染色结果显示，大鼠组织创面成熟血管数量在外泌体联合[（28.536±1.882）个/mm2vs.（4.712±1.883）个/mm2，P<0.01]。结论外泌体及分化，促进成熟肉芽组织沉积，加速创面血管形成，进一步促进组织创面修复，为临床上慢性创面的细胞治疗提供了新的思路。CD31、血管平滑肌细胞标志物表达明显下降（均的P<0.01），周细胞标记物组大鼠伤口创面在第蛋白可定向诱导qRT-PCRKlf4、Oct4α-SMAmRNABMSCsWnt3aWnt3aBMSCs119关键词:骨髓间充质干细胞;定向分化;中图分类号:R329.21DOI:10.3870/j.issn.1672-0741.2019.06.002外泌体;Wnt3a;归巢;创面再生HomingandDirectionalDifferentiationofMSCsInducedbyExosomeCombinedwithWnt3aYeTao，LiYongzhong，FuAihuaetalDepartmentofOsteology，TheSecondPeople`sHospitalofYichang（TheSecondPeople`sHospitaloftheChinaThreeGorgesUniversity），Yichang443000，ChinaAbstractObjectiveToexplorethespecificroleofWnt3acombinedwithexosomeinthehominganddirectionaldifferen-tiationofmesenchymalstemcellsandtheacceleratedcutaneoustissuereconstructioninrats.MethodsTheexosomederivedfromBMSCswascollectedandfurtherutilizedtoinducethedifferentiationofBMSCsinthecombinationwiththeWnt3a.Invitro，thespecificmarkersrelatedtotheangiogenesisintheBMSCswereevaluatedbyusingWesternblottingandqRT-PCR.Invivo，thefullcutaneousdefectsintheratswerecreatedandWnt3acombinedwithexosomewereinjectedaroundthewounds，andthentheacceleratedeffectofthiscombinatorytherapytowardsthewoundswasassessedbyusingtheimmunofluorescentstaining，WesternblottingandqRT-PCR.ResultsTheresultsofRT-PCRshowedtheincreasedexpressionofKlf4andOct4，NG2，VEGFandCD31，aswellastheα-SMAintheexosomecombinedwithWnt3agroupcomparedwithcontrolgroup，demon-stratingthedifferentiationofBMSCs.Invivo，theratstreatedwithexosomecombinedwithWnt3ashowedacceleratedrepairofthewoundsonday16[（93.05±2.72）%]comparedwithcontrolgroup（P<0.01）.TheresultsofthematurityscoreofthegranulationtissueandwoundsshowedtheenhancedwoundrepairintheexosomecombinedwithWnt3agroupcomparedwithcontrolgroup（P<0.01），furthermore，morenewformedbloodvesselswereobservedonday9comparedwithcontrolgroup[（48.260±1.821）/mm2vs.（8.484±1.291）/mm2，P<0.01].Inaddition，theimmunofluorescentstainingshowedthatthenumberofthematurebloodvesselsinthewoundsoftheratstreatedwithexosomecombinedwithWnt3awereincreasedcom-*国家自然科学基金青年科学基金资助项目（No.81402568）叶△通讯作者，Correspondingauthor，E-mail:lhwjqq@163.com年生，主治医师，E-mail:15897532022@163.com涛，男，1980万方数据·836·华中科技大学学报（医学版）2019年12月第卷第期648paredwiththecontrolgroup[（28.536±1.882）/mm2vs.（4.712±1.883）/mm2，P<0.01].ConclusionOurstudydemon-stratedthatexosomecombinedwithWnt3aisabletoinducethedirectdifferentiationofBMSCs，leadingtothedepositofmaturegranulationtissueandenhancedformationofbloodvesselstoacceleratethewoundrepair.Keywordsbonemarrowmesenchymalstemcells;exosome;Wnt3a;homing;differentiation;woundrepair随着人们生活水平提高，糖尿病、血管相关性疾病及相关代谢综合征的发生率逐年递增，由此引发的多种慢性难愈性创面也成为临床上的常见治疗难题[1-2]。而且，由于其临床疗效不能令人满意，至今仍是外科医生面临的一大挑战[3-4]。多聚甲醛固定，PBS原代细胞爬片免疫荧光染色50μL漂洗3%3封闭20min。加入约1.1.2BMSCs细胞爬片，4%作液孵育后加入制作次，破膜工过氧化氢溶液，室温避光孵育。稀释的各类一5%BSA抗[VEGF（1∶200）、CD31（1∶100）、NG2（1∶50）、α-SMA（1∶100）、Oct4（1∶100）、Klf4（1∶100）]覆孵育盖玻片，4℃50min。加5min。加入封片剂，在光镜下随机选取个视野，观察阳性细胞并拍照。二抗（1∶50），4℃染液，避光孵育过夜。加50μLDAPI6去除培养板中培养液，1.1.3qRT-PCR加1mLPBS溶液洗涤，采用BMSCscDNA合成，PCRUniversalRNAExtractionKit规流程进行s），紧接着为s，72℃20s），最后再以温72℃的速度进行熔解。以所用引物序列见表个循环扩增（分别为1℃40TaKaRaMiniBEST提取RNA。按照常扩增:预变性（95℃6095℃15s，58℃20持续升2-ΔΔCt法计算结果。qRT-InvitrogenBiotech-后以每5min20s1，引物由PCRnologyCo.LTD中国公司合成。表1PCR所用引物序列基因CD31α-SMAVEGFNG2Oct4Klf4Table1PrimersequencesforPCR引物序列退火温度（℃）正向:GATCTCCATCCTGTCGGGTAAC反向:GTGTCATTCACGGTTTCTTCGT正向:CAACCCCTATACAACCATCACAC反向:CCCAAACTGCTTGCGTAACC正向:ATCTTCAAGCCGTCCTGTGTG反向:AGGTTTGATCCGCATGATCTG正向:TTACCTTGGCCTTGTTGGTC反向:GATGATCTGTTTGGCCTGCT正向:GTGTTCAGCCAGACAACCATCT反向:GGTCTCCGATTTGCATATCTCCT正向:AGTCCCGAGGAACTGCTGAAC反向:GGCATGAGCTCTTGATAATGGAG正向:GCTGTGGTTGAGCCCTACAAT反向:GTAGGTTGGGCGCTCAATGT58585858585858RNA近年来，大量研究倾向于利用移植干细胞，通过旁分泌效应实现其定向修复再生的功能[5-6]。有文献报道，干细胞来源的外泌体（exosome）在受损组织修复方面扮演着重要角色，特别是外泌体内所包含的蛋白或成分已被证明能够参与靶向细胞的生物学行为[7-11]。但是，外泌体功能在特定条件下会受到抑制，例如肥胖会限制外泌体的促血管生成能力。临床上面对复杂的创面微环境时，如何最大程度发挥外泌体的作用引起了人们的重视[12-13]。目前单独应用外泌体修复皮肤创面仍存在较多问题，临床上需要引入联合应用方案以提高其修复与再生疗效。WntWntWnt3a蛋白作为信号通路的经典蛋白，富含半胱氨酸，广泛参与调节细胞生物学行为[14]。本课题组前期研究发现蛋白在骨髓间充质干细胞（bonemarrowmesenchymalstemcells，BMSCs）参与皮肤软组织缺损的修复过程中占有重要地蛋白在体内不稳定，因此，本研究将位[15-16]。Wnt蛋白作为治疗手段，观察该联合外泌体联合方案对诱导定向分化为皮肤血管化所需细胞的作用，以期进一步提升创面肉芽组织修复功能，促进伤口愈合。BMSCsWnt3a材料与方法1细胞实验方法1.1SDBMSCs和外泌体的提取、培养及BMSCs大鼠购自三峡大学实验动物中的提取、培养和鉴定按参考源性外泌体的大鼠骨髓1.1.1实验用鉴定心。大鼠原代文献[17]报道的方法进行。BMSCs提取按文献[18]报道的方法进行。常规培养组和SCs，分为对照组、Wnt3asome+Wnt3a组加入Wnt3a司），ExosomemL），Exosome+Wnt3a体，对照组不处理。置于隔次，共培养组，6Wnt3a（终浓度为组加入外泌体（终浓度为组、Exosome孔板培养，每组Wnt3a37℃、5%CO27~10d。40μg/蛋白和外泌培养箱中，每Exo-个复孔。公200μg/L，R&D万方数据组加入天换液331BM-α-tubulin动物实验方法1.2动物模型制作、分组及处理大1.2.1鼠购自三峡大学实验动物中心。嵌合体大鼠模型按个文献[19]描述进行CM-DiI线照射。骨髓移植:取与正常雄性大鼠不含实验用标记的BMSCs1000SDSDX的骨髓细胞按制成混悬液约BM-0.25mL，尾SCs1∶1000叶涛等.外泌体与Wnt3a联合诱导间充质干细胞归巢及定向分化·936·静脉注入前述嵌合体模型。移植后饲养个月。34122060mg/kg组，每组将造模成功的大鼠随机分为组，皮肤伤口周缘注射只，腹腔注射盐酸氯胺酮进行麻醉。以后正中线为纵径，行椭圆形全层皮肤切口，切除皮肤、皮下组织直至腰背筋膜。根据不同组别，在皮肤伤口周缘等分以后分点进行皮下注射。分组情况如假手术组，除全层皮肤切口以外，不做其余处下:①理;②Wnt3a溶液（PBS组，皮肤伤口周缘注射置，终浓度为皮肤伤口周缘先注射度为浓度为半透膜（VSD口。500μLWnt3a200μg/L）;③Exosome配组，配置，终浓配置，终组大鼠手术完毕后均以生物医疗技术公司，武汉）覆盖以封闭伤外泌体溶液（PBS100μg/L）;④Exosome+Wnt3a200μg/L），再注射外泌体溶液（PBS配置，终浓度为100μg/L）。4溶液（PBS500μLWnt3a病理学检测分别于术后第3、7、111.2.216日，观察各组动物伤口愈合情况。同时，取伤口处组织经伊红染色，用于观察伤（HE）染色、Masson`sTrichrome口肉芽组织形成及伤口组织成熟度[20]。包埋剂包埋，-80℃保存，行苏木精-OCT和1.2.3组织切片免疫荧光染色取大鼠伤口组织，5μm包埋，-20℃下于冰冻切片机中以CD31（罗丹明，红色）和连续OCT复染（蓝色），观切片，然后行免疫荧光染色，DAPI察α-SMA（FITC，绿色）表达情况，黄色代表成熟血管沉积。在光镜下随机选取软个视野，观察阳性细胞并拍照。最后以件将各通道照片置于同一视野下，并分析染色的色）共染（黄色）情况。CM-DiIBMSCs（红色）及各细胞相关分子标记（绿IPP61.3数±验，以SPSS23.0统计学方法运用标准差（-x±s）表示。组间均数比较采用P<0.05软件进行统计分析。结果以均检为差异具有统计学意义。t结果22.1大鼠所分离的细胞培养BMSCs体外分离及培养72h1A）。10d后在光镜下可见呈纺后细胞间隙变小，形态锤状或梭形（图类似于成纤维细胞，呈漩涡状生长（图1B），与课题组前期报道一致[15]。同时，免疫荧光结果显示，细表达呈阳性，提示该细胞具有干胞内细胞多能分化的特性（图应用于后期实验。1C），可作为BMSCsOct4Klf4及A:分离培养干细胞多能性相关标记物后，BMSCs72h贴壁生长情况;B:10d后，BMSCsOct4及Klf4，经过贴壁生长情况;C:免疫荧光染色证实所提取细胞的细胞核内高表达联合作用后表达下降及Oct4Klf4Exosome+Wnt3a图大鼠1BMSCs的形态学观察及鉴定Fig.1ThemorphologyoftheharvestedBMSCs的定向分化BMSCs和Klf42.2外泌体联合采用Wnt3a诱导检测qRT-PCROct4mRNA的表干表达明显下降Wnt3aBMSCs后细胞中Klf4、Oct42A）。采用达结果显示，与对照组相比，外泌体联合预[（0.427±0.018），（0.382±0.046），均（图血管内皮细胞标志物细胞标志物α-SMAmRNA联合干预后，各类细胞标志物（图白表达与P<0.01]NG2、和CD31、血管平滑肌水平表达情况，发现经表达明显增高2B）。免疫荧光染色的结果显示各类标志物蛋检测周细胞标志物表达变化趋势一致（图qRT-PCRmRNAVEGF2C）。万方数据mRNA2.3加快动物组织创面愈合外泌体联合将造模成功的大鼠随机分为Wnt3a41616和3、7、11组，分别于术后第日，观察各组动物伤口愈合情况，并进行评价。结果表明，第天，Exosome+Wnt3a组大鼠伤口创面愈合率可达（93.05±2.72）%，明显3A）。随后，采用肉芽高于其它各组（P<0.01）（图组织和伤口成熟度评分评估大鼠组织伤口修复情况，结果显示天的评分高于假手术组，差异具有统计学意义（P<伊红染色和0.01）（图组Masson3B）。同时，通过苏木精-染色，观察到第Exosome+Wnt3aExosome+Wnt3a组在术后第天1611·046·华中科技大学学报（医学版）2019年12月第卷第期648大鼠伤口创面有成熟肉芽组织沉积，表现为丰富的血管组织及周围的成熟胶原排列（图3C）。A:qRT-PCR检测BMSCsBMSCs检测在不同干预措施下，相关特异性标志物在不同干预措施下，其多能干细胞相关标记物NG2、VEGF、CD31Klf4和和观察Exosome+Wnt3a联合诱导后，BMSCs图中相关特异性标记物外泌体联合Wnt3a2Oct4mRNA表达情况，**P<0.01;B:qRT-PCR表达情况，**P<0.01;C:免疫荧光染色a-SMA蛋白表达情况a-SMAmRNANG2、VEGF、CD31诱导的定向分化BMSCs和Fig.2ThedifferentiationofBMSCsinducedbyexosomecombinedwithWnt3a组;②:Exosome组;A:伤口愈合曲线检测各组大鼠创面愈合情况，与假手术组比①:Sham伊红（HE）染色、Mas-较，**P<0.01;B:肉芽组织形成及创面成熟度评分评价各组大鼠创面成熟度情况，**P<0.01;C:苏木精-son组;④:Exosome+Wnt3a天各组大鼠创面修复情况组;③:Wnt3a染色观察术后第16万方数据Fig.3Woundhealingandrepairaftersurgeryindifferentgroups图3术后组织创面愈合和修复情况叶涛等.外泌体与Wnt3a联合诱导间充质干细胞归巢及定向分化·146·和CD31通过α-SMA免疫荧光双染共定位各组创面组织中血管生成情况，其中双染阳性标记为4A）。结果显示，Exosome+Wnt3a成熟血管[21]（图组大鼠第天出现了大量的新生血管，远多于假手术组[（48.260±1.821）个/mm2vs.（8.484±1.291）个/mm2，P<0.01，图天，Exosome+组大鼠组织创面成熟血管数量要明显多于Wnt3a假手术组[（28.536±1.882）个/mm2vs.（4.712±4B]。第1191.883）个/mm2，P<0.01，图4C]。16通过CM-DiI标记，我们观察到第天，Exo-组创面归巢的内源性干细胞数量远some+Wnt3a远大于假手术组[（2871.163±347.126）vs.（387.087±99.039），P<0.01，图5A、B]。同时，免组大部分疫荧光染色结果显示，Exosome+Wnt3a归巢的干细胞分化为血管化所需的周细胞及血管内皮细胞（图5C）。组;②:Exosome组;③:Wnt3a组;④:Exosome+Wnt3a组;A:CD31①:Sham血管，蓝色表示细胞核;B:各组大鼠创面新生血管计数，**P<0.01;C:各组大鼠创面成熟血管计数，**P<0.01α-SMA和共定位免疫荧光染色，其中黄色表示成熟图4术后创面血管再生情况Fig.4Regenerationofthebloodvesselsinthewoundsofdifferentgroups讨论3本文重点研究干细胞的旁分泌效应。通过联合WntWnt3a蛋白与通路信号分子应用经典BMSCs源性的外泌体，诱导干细胞分化为血管内皮细胞与平滑肌细胞，加速皮肤创面的血管新生，在细胞和动物水平验证了联合疗法的有效性，从分子水平证实了外泌体的联合应用策略能够诱导干细万方数据+Wnt3a胞的定向分化，提高外源性干细胞移植后的存活率，促进创面新生血管的形成和肉芽组织的成熟，最终实现修复大面积皮肤缺损的治疗目的。近年来，越来越多的学者倾向于移植干细胞通过旁分泌效应---外泌体来实现其组织修复再生功能[5-6，8，11，16，22-24]。有部分学者单独应用外泌体修复创面，结果显示外泌体能够促进表皮及真皮细胞再生[25-26]，但在复杂的创面及机体功能失调时外泌体·246·华中科技大学学报（医学版）2019年12月第卷第期648的作用并不稳定[12]，并且外泌体的体外获取量还无法满足目前临床上的需求。由此，本研究设计了联合应用外泌体蛋白的方案用于治疗大面积皮肤缺损以弥补上述缺陷，体内实验证实，联合疗法能够提高创面愈合率，增加创面肉芽组织的形成和成熟，最终显著促进创面愈合。+Wnt3a近年研究发现，当皮肤组织受到损伤时，机体可动员归巢到受损皮肤病灶，在损伤局部，它可分化为上皮细胞等皮肤效应细胞，进而促进缺损组织的修复和再生[24，27]。但归巢过程中干细胞的BMSCs动员差异较大，到达受损部位后的活性尚不能完成修复组织器官损伤的任务[28]。本实验所建立的荧光/普通大鼠嵌合体模型可以实时观察内源性SD的归巢、迁移及分化。实验结果也显示，机BMSCs体内源性间充质干细胞归巢至创面后在外泌体及蛋白的诱导下，于自分泌及旁分泌双重作用Wnt3a下完成定向分化（周细胞、血管内皮细胞、血管平滑肌细胞），进而加速创面愈合与修复，完成皮肤软组织缺损的重建，该研究结果将为今后临床上慢性创面的治疗提供新的思路。A、B:激光共聚焦显微镜显示观察归巢的干细胞及CD31α-SMA图Exosome+Wnt3a组大鼠术后第7、16天创面归巢的自体BMSCs数量，**P<0.01;C:免疫荧光染色的共定位，黄色表示已定向分化，红色表示未发生分化，蓝色为细胞核各组大鼠术后创面内源性间充质干细胞归巢及分化情况5Fig.5ThehominganddifferentiationofBMSCsforwoundrepairindifferentgroups+Wnt3a综上，本研究率先采用外泌体蛋白联合治疗慢性难愈性创面，体内及体外实验证实该联合疗法能够刺激机体动员内源性干细胞归巢，并于创面诱导干细胞分化为周细胞、血管内皮细胞及平滑肌细胞，促进创面肉芽组织成熟，增强创面血管化，为临床上治疗慢性创面提供了较好的选择。参考文献[1]EdwardsH，FinlaysonK，CourtneyM，etal.Healthservicepathwaysforpatientswithchroniclegulcers:identifyingef-fectivepathwaysforfacilitationofevidencebasedwoundcare[J].BMCHealthServRes，2013，13:86.谢承成，陈南，吴迪开放性骨折术后创面感染的病原菌及耐.万方数据[2]药性分析[J].实用骨科杂志，2018，24（8）:682-686.[3]SingerAJ，ClarkRA.Cutaneouswoundhealing[J].NEnglJMed，1999，341（10）:738-746.[4]HrabchakC，FlynnL，WoodhouseKA.Biologicalskinsubsti-tutesforwoundcoverandclosure[J].ExpertRevMedDe-vices，2006，3（3）:373-385.[5]LaiRC，ArslanF，LeeMM，etal.ExosomesecretedbyMSCreducesmyocardialischemia/reperfusioninjury[J].StemCellRes，2010，4（3）:214-222.[6]ArslanF，LaiRC，SmeetsMB，etal.Mesenchymalstemcell-derivedexosomesincreaseATPlevels，decreaseoxidativestressandactivatePI3K/Aktpathwaytoenhancemyocardial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