一种具有G418抗性筛选标记的慢病毒RNA干扰表达载体的构建及应用
【摘要】 目的:构建具有新霉素抗性筛选标记的RNA干扰慢病毒表达载体，并检测它对乙型肝炎病毒x基因（HBx）mRNA表达的抑制作用。方法:从pcDNA3.0载体中扩增新霉素抗性基因并插入删除嘌呤霉素编码序列的pLKO载体中;将改构的RNA干扰载体包装成慢病毒后感染肝癌细胞HepG2，并检测感染细胞对G418的抵抗作用;为验证改构RNA干扰载体的有效性，设计了2条针对HBx的RNA干扰序列以及针对编码萤光素酶cDNA的干扰序列并插入该载体，将含新霉素筛选标记的HBx的RNA干扰载体与辅助质粒在293T细胞中包装成慢病毒并感染过表达HBx的HepG2（嘌呤霉素抗性）细胞，运用G418筛选出稳定混合克隆，提取细胞总RNA，运用RT-qPCR检测其在HepG2细胞中对HBxRNA表达的抑制作用。结果:构建的载体与辅助质粒包装出的慢病毒感染肝癌细胞后，细胞获得G418抗性;HBxRNA干扰序列克隆入该载体可有效抑制肝癌细胞中过量表达的HBxmRNA。结论:构建了具有新霉素抗性筛选标记的RNA干扰慢病毒表达载体，运用该载体可有效筛选出抑制目的基因表达的G418抗性的稳定细胞株。
