产志贺毒素多重耐药大肠杆菌噬菌体的生物学特性及全基因组分析
【摘要】 为探明大肠杆菌噬菌体的生物学特性和全基因组特征,本研究以在广西某猪场污水中分离得到的1株产志贺毒素且多重耐药的大肠杆菌GXEC010为宿主菌,同时在污水中分离到1株具有裂解作用的噬菌体,并通过透射电镜观察、最佳感染复数测定、一步生长曲线绘制、热敏感性与酸碱度稳定性评估、杀菌试验及全基因组测序等方法分析该噬菌体的生物学特性与基因组特征.结果表明,分离纯化得到能高效裂解大肠杆菌GXEC010的噬菌体,命名为vB_EcoM_BP10,其噬菌斑呈清晰透明,边缘光滑整齐;该噬菌体的最佳感染复数为1;一步生长曲线结果显示,感染宿主菌潜伏期为5min,爆发期为65min,爆发量为51;可耐受温度范围为30~60℃,在pH为5~8的环境中能维持稳定性;噬菌体杀菌试验结果显示,感染复数(MOI)为1时噬菌体vB_EcoM_BP10具有良好的杀菌效果.全基因组测序结果表明,噬菌体vB_EcoM_BP10基因组总片段长度为52288bp,GC含量为44.16%,含有71个阅读框(ORF).GO功能注释表明,噬菌体vB_EcoM_BP10可参与小分子代谢、细胞氮化合物代谢等生物学过程中,具备核苷酸转移酶活性、离子结合、DNA结合等分子功能.与EscherichiaphageST32、EnterobacteriaphagephiEcoMGGJ1的亲缘关系较近.综上所述,噬菌体vB_EcoM_BP10具有清晰的宿主受体特异性,良好的热稳定性和酸碱稳定性,本研究结果能为有效防控产志贺毒素多重耐药大肠杆菌奠定一定的理论基础.关键词:志贺毒素;噬菌体;多重耐药;全基因测序中图分类号:S852.61文献标识码:ADoi:10.16431/j.cnki.1671G7236.2020.02.005开放科学(资源服务)标识码(OSID):BiologicalCharacteristicsandGenomeAnalysisofShigaToxinGproducingandMultidrugGresistantEscherichiacoliPhages(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology,GuangxiUniversity,Nanning530004,China;WEIDeyuan1§,LUZening2§,ZHANGCong1,GEChenling1,WANGXiaoye1∗2.AquaticAnimalHusbandryandVeterinaryStation,ShuangqiaoTown,WumingDistrict,Nanning530104,China)Abstract:ToexplorethebiologicalcharacteristicsandgenomecharacteristicsofEscherichiacoliphages,inthisstudy,aShigatoxinGproducingmultiGdrugresistantEscherichiacolistrainGXGEC010wasisolatedfromthesewageofaswinefarminGuangxi,andalyticphagestrainwasisoGlatedfromthesewage,andthroughthetransmissionelectronmicroscope,determinationofbestmultiplicityofinfectionintheplural,oneGstepgrowthcurvedrawing,thermalsensitivityandpH收稿日期:2019G08G19基金项目:国家自然科学基金青年基金(31502079);广西自然科学基金(2017GXNSFAA198071);南宁市科学研究与技术开发计划重点研发计作者简介:韦德源(1992G),男,广西贵港人,硕士生,研究方向:临床兽医学,EGmail:1021459902@qq.com划项目(20182024G2)陆泽宁(1980G),男,广西南宁人,本科,兽医师,研究方向:动物疾病防控,EGmail:Zening.6021891@163.com韦德源和陆泽宁对本文具有同等贡献,并列为第一作者∗通信作者:王晓晔(1987G),男,山东潍坊人,博士,研究方向:动物病毒学,EGmail:wangxiaoye161@163.com2期韦德源等:产志贺毒素多重耐药大肠杆菌噬菌体的生物学特性及全基因组分析353stabilityevaluation,sterilizationexperimentandwholegenomesequencingmethodstoanalyzethebiologicalcharacteristicsandgenomecharacteristicsofthephage.TheresultsshowedthatthephagewhichcouldefficientlylyseEscherichiacoliGXEC010wasisolatedandpurified,andnamedasvB_EcoM_BP10.Theoptimalmultiplicityofinfectionthisbacteriumwas1.TheresultsofoneGstepgrowthcurveshowedthattheincubationperiodofinfectedhostbacteriawas5min,theoutGbreakperiodwas65min,andtheoutbreakquantitywas51.Thetolerabletemperaturerangewas30to60℃,anditcouldbemaintainedstableinthepHof5to8.TheresultsofbacteriophagebactericidalexperimentshowedthatthebacteriophagevB_EcoM_BP10hadagoodbactericidaleffectwhenMOI=1.CompletedgenomesequencingresultsshowedthatthetotalfragmentlengthofphagevB_EcoM_BP10was52288bp,GCcontentwas44.16%,andincluded71ORF.TheGOfunctionalnotesindicatedthatphagevB_EcoM_BP10couldparticipateinsmallmoleculemetaboGlism,cellnitrogencompoundmetabolismandotherbiologicalprocesses,andhadmolecularfuncGtionssuchasnucleotidetransferaseactivity,ionbindingandDNAbinding.ThisbacteriumwascloselyrelatedtoEscherichiaphageST32andEnterobacteriaphagephiEcoMGGJ1.Inconclusion,thephagevB_EcoM_BP10inthisstudyhadclearhostreceptorspecificity,goodthermalstabilityandacidGbasestability,whichcouldlayatheoreticalfoundationfortheeffectivepreventionandcontrolofShigatoxinGproducingmultidrugGresistantEscherichiacoli.Keywords:Shigatoxin;phage;multipledrugresistance;completedgenomesequencing产志贺毒素大肠杆菌(ShigatoxinGproducingE.coli,STEC)作为一种人畜共患的肠道致病菌,由于能引发水样腹泻(waterydiarrhea)、出血性结肠炎(hemorrhagiccolitis,HC)[1]、溶血性尿毒综合征(hemolyticuremicsyndrome,HUS)[2]等疾病而成为公共卫生方面最具挑战性的病原体之一.产志贺毒素大肠杆菌主要由没有交叉抗性的stx1和stx2两种基因型构成[3],尤其在反刍动物O157∶H7血清型中高发[4].近年来,食品源性动物养殖中为防控STEC疾病的发生,滥用抗生素药物,致使STEC菌株的药物敏感性急剧下降[5],多重耐药(multiGdrugresistant,MDR)情况愈发明显,缓解多重耐药和极端耐药(extremelydrugresistant,XDR)带来的挑战变得迫在眉睫.近年来,噬菌体由于其分布范围广、特异性强、增殖迅速且不破坏宿主体内的正常菌群[6]等特点引起人们的关注,并被认为是能缓解抗生素耐药严重局面的首选替代治疗药物[7].噬菌体通过自身尾丝蛋白和细菌表面受体共同决定裂解谱[8],该特点决定噬菌体的高度专一性,但同时也给噬菌体与不同宿主菌之间的相互作用带来局限性.针对目前的现状,分离并鉴定更多噬菌体将为提高个性化治疗及规模化生产应用奠定基础.本研究分离得到1株对噬菌体,通过探究其生物学特性和全基因组分析,为产志贺毒素且多重耐药的大肠杆菌具有裂解作用的自治区南宁市某猪场化粪池污水用于噬菌体的深入研究噬菌体作用机制和生产应用提供借鉴.1材料与方法1.1材料1.1.1宿主菌与噬菌体宿主菌产志贺毒素大肠杆菌GXEC010及用于宿主谱分析的其他菌株均采集自广西壮族自治区南宁市某猪场,保存于广西大学动物科学技术学院临床实验室.采集广西壮族分离.1.1.2主要试剂NaCl和MgSO4均购自天津市科密欧化学试剂有限公司;LB液体培养基、LB固体培养基、PEG8000均购自北京索莱宝科技有限公司;药敏纸片购自杭州滨和微生物试剂有限公司.1.2方法1.2.1细菌分离及鉴定将采集的粪便拭子用平板法划线接种于伊红美蓝培养基上,置于37℃培养箱18~24h.挑单个菌落加到LB液体培养基置于摇床培养6~8h.水煮法提取DNA作为模板,大肠杆菌16SrRNA通用引物27F(5′GAGAGGTTTGATCMTGGCTCAGG3′)和1492R(5′GGGTGTACCTTGTTACGACTTG3′)由广州华大基因公司合成.用PCR扩增细菌16SrRNA.PCR反应体系25μL:2×TaqPCRGreenMix12.5μL,ddH2O8.5μL,上、下游引物各1μL,DNA模板中国畜牧兽医4532μL.PCR反应条件:94℃预变性5min;95℃变性30s,56℃退火30s,72℃延伸1min,共32个循环;72℃延伸10min.取10μLPCR扩增产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳检测,用凝胶程序分析系统观察结果,将鉴定正确的PCR产物送广州华大基因公司测序.1.2.2噬菌体分离纯化与鉴定采集猪场化粪池中污水样品,利用不同滤膜孔径大小除菌的方法[9],获得含有噬菌体的原液.采用双层平板法检测和筛选烈性噬菌体[10],并测定噬菌体的效价.参考«分子克隆实验指南»[11]中聚乙二醇沉淀法回收裂解物中噬菌体颗粒的方法,纯化并浓缩噬菌体.将纯化后的噬菌体采用2%磷钨酸(PTA,w/V)染色后[12],使用透射电子显微镜观察其形态特征.1.2.3噬菌体宿主谱分析采用点斑法[13]测定噬菌体宿主范围.具体方法如下:取细菌的过夜培养物,均匀涂布在LB培养基平板上;取10μL噬菌体悬液滴加在菌苔表面,并滴加生理盐水作对照,待液滴干燥后倒置于37℃培养12~18h,观察结果.1.2.4宿主菌药物敏感性分析将宿主菌GXGEC010按照美国临床实验室标准委员会(CLSI)推荐的KGB法进行15种抗生素的药物敏感性检测.1.2.5噬菌体生物学特性分析参考CareyGSmith等[14]方法,将宿主菌培养至对数生长期时,运用平板记数法测定宿主菌的个数.按照MOI分别为1、0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001的比例分别加入噬菌体纯培养液和宿主菌,利用双层法测定效价并评估噬菌体最佳MOI.参考葛展霞等[15]方在伊红美蓝平板上为带有墨绿色金属光泽的菌47卷法测定噬菌体的一步生长曲线.通过Jamal[16]和孙立厂等[17]方法测量温度敏感性及不同pH下噬菌体的酸碱稳定性.根据包红朵等[12]方法比较不同MOI下噬菌体的杀菌效果.1.2.6噬菌体全基因组分析运用碱裂法提取噬菌体DNA[11],并用10%琼脂糖凝胶电泳检测基因组的完整性.基因文库构建和全基因测序均由上海派森诺生物科技股份有限公司完成.2结果2.1细菌的分离鉴定落(图1A),在显微镜下可见革兰氏阴性的短杆菌(图1B).将25株细菌基因组DNA进行16SrRNAPCR扩增,扩增出大小为1540bp的目的条带(图2),测序结果在NCBI中进行比对,结果显示均为大肠杆菌.2.2噬菌体的形态学鉴定以产志贺毒素大肠杆菌GXEC010为宿主菌,运用双层平板法进行噬菌体分离.经反复纯化后得到清澈透亮,大小一致,边缘整齐无晕环的噬菌斑(图3A),即纯化噬菌体,命名为vB_EcoM_BP10,其呈现典型的裂解性噬菌体特征.经负染法后在电镜观察,该噬菌体的头部为直径约60nm的多面体,尾部为直径可达20nm左右,长约90nm的圆柱体(图3B).依据国际病毒分类委员会分类规则,判定该噬菌体为肌尾噬菌体科.A,菌落形态;B,革兰氏染色镜检图(100×)A,Colonymorphology;B,Gramstainingmicroscopy(100×)图1分离菌形态学鉴定Fig.1Morphologicalidentificationoftheisdates2期韦德源等:产志贺毒素多重耐药大肠杆菌噬菌体的生物学特性及全基因组分析553M,DL2000DNAMarker;N,阴性对照,1,GXEC010,2~25,分别为大肠杆菌GXEC008、GXEC087、GXEC091、GXGEC096、GXEC094、GXEC077、GXEC089、GXEC090、GXEC095、GXEC092、GXEC078、GXEC088、GXEC046、GXGEC087、GXEC093、GXEC059、GXEC056、GXEC067、GXEC104、GXEC032、GXEC072、GXEC040、GXEC103和GXGEC011M,DL2000DNAMarker;N,Negativecontrol;1,GXEC010;2G25,E.coliGXEC008,GXEC087,GXEC091,GXGEC096,GXEC094,GXEC077,GXEC089,GXEC090,GXEC095,GXEC092,GXEC078,GXEC088,GXEC046,GXGEC087,GXEC093,GXEC059,GXEC056,GXEC067,GXEC104,GXEC032,GXEC072,GXEC040,GXEC103andGXGEC011,respectively图2分离菌16SrRNA基因PCR扩增结果电泳图Fig.2ElectrophoresismapofPCRamplificationresultsoftheisolates16SrRNAgeneA,噬菌体vB_EcoM_BP10的噬菌斑;B,噬菌体vB_EcoM_BP10负染后电镜图(150000×)A,PhagevB_EcoM_BP10;B,ElectronmicrographofphagevB_EcoM_BP10afternegativestaining(150000×)图3噬菌体vB_EcoM_BP10的形态学鉴定Fig.3MorphologicalidentificationofphagevB_EcoM_BP102.3噬菌体的宿主谱分析通过噬菌体vB_EcoM_BP10对来自广西周边地区不同猪场粪便式子分离得到的24株多重耐药且产志贺毒素大肠杆菌的裂解能力进行分析.结果表明,该噬菌体对产志贺毒素大肠杆菌的裂解具有一定的特异性,仅对GXEC008和GXEC011两株菌能形成噬菌斑(表1).653表1噬菌体vB_EcoM_BP10的宿主谱Table1HostspectraofphagevB_EcoM_BP10中国畜牧兽医菌株编号来源结果广西桂林广西桂林广西来宾广西来宾广西来宾广西柳州广西来宾广西来宾Source广西南宁Results+-----------StrainNo.GXEC008GXEC087GXEC091GXEC096GXEC094GXEC077GXEC089GXEC090GXEC095GXEC092GXEC078GXEC088+,形成空斑;-,不形成空斑+,Formingplaque;-,Noplaqueformation2.4宿主菌GXEC010药物敏感性分析采用纸片法对产志贺毒素大肠杆菌GXEC010的药物敏感性进行评估.结果表明,该大肠杆菌对βG内酰胺类(氨苄西林、阿莫西林)、多肽类(多黏菌表2宿主菌GXEC010的药物敏感性结果Table2ResultsofdrugsensitivityofhostbacteriumGXEC010广西来宾广西柳州广西桂林药物抑菌圈直径InhibitoryzonediameterDrugs氨苄西林Ampicillin阿莫西林Amoxicillin多黏菌素BPolymyxinB多黏菌素EPolymyxinE多西环素Doxycycline林可霉素Lincomycin磺胺嘧啶Sulfadiazine阿奇霉素Azithromycin头孢吡肟Cefepime头孢噻肟Cefotaxime环丙沙星Ciprofloxacin诺氟沙星Norfloxacin阿米卡星Amikacin庆大霉素Gentamicin美罗培南MeropenemR,耐药;I,中介;S,敏感R,Resistant;I,Intermediate;S,Sensitive101177101211122626242619132447卷结果Results-----------+菌株编号StrainNo.GXEC046GXEC087GXEC093GXEC059GXEC056GXEC067GXEC104GXEC032GXEC072GXEC040GXEC103GXEC011来源Source广西南宁广西桂林广西来宾广西河池广西河池广西南宁广西桂林广西南宁广西柳州广西南宁广西桂林广西南宁素B、多黏菌素E)、四环素类(多西环素)、林可霉类(林可霉素)、磺胺类(磺胺嘧啶)、大环内酯类(阿奇霉素)等药物敏感性较弱(表2),对多种抗菌药表现出一定的抗性,耐药情况严重,属于多重耐药大肠杆菌.判定标准StandardI14~1614~178~118~1113~1516~1813~1619~2423~2516~2013~1613~1613~1420~22S≥17≥18≥12≥12≥16≥19≥17≥13≥25≥26≥21≥17≥17≥15≥23mm结果ResultsRRRRRRRRSSSSSISR≤13≤13≤8≤8≤12≤15≤12≤12≤18≤22≤15≤12≤12≤12≤192期2.5噬菌体最佳MOI值,可判断不同浓度下噬菌体的最佳MOI.由表3可知,当MOI<1时,随着MOI值的增加,噬菌体的效价随之增大;当MOI>1时,噬菌体的效价在160×108~2.27×108PFU/mL之间浮动;当MOI=1时,噬菌体的效价最高,为2.94×108PFU/mL,故MOI=1为最佳MOI.表3噬菌体最佳MOITable3OptimalphageMOIMOI/(PFU/CFU)0.0010.010.111010010002.6噬菌体一步生长曲线分析3.40×1075.20×1078.00×1072.94×1081.60×1081.70×1082.27×108效价/(PFU/mL)将噬菌体vB_EcoM_BP10在与宿主菌GXG韦德源等:产志贺毒素多重耐药大肠杆菌噬菌体的生物学特性及全基因组分析通过计算感染初期噬菌体数与宿主菌数的比753EC010进行反应.结果表明,起初的5min内噬菌体效价无明显变化,随着时间的延长,噬菌体效价不断升高,一段时间后到达平台期,即噬菌体潜伏期为5min,爆发期持续65min,爆发期时噬菌体效价最高可达2.9×107PFU/mL,与初期细菌数量的5.6×105CFU/mL相比,能明显抑制细菌增殖(图4A).由裂解量=噬菌体末期数量/初期细菌数量可知,噬菌体vB_EcoM_BP10具有较强的裂解能力,裂解量为51.2.7噬菌体热稳定性及酸碱稳定性通过对在不同温度条件下噬菌体vB_EcoM_BP10耐热程度的研究可知,当温度在30~60℃之间时,噬菌体的效价趋于稳定.当温度超过70℃以后,随温度的升高,噬菌体活性逐步下降.当温度达到80℃时,噬菌体效价为0,已完全失活(图4B).由此可知,高温可严重影响噬菌体活性.对噬菌体的酸碱稳定性进行评估可知,当pH≤5或pH≥8时,噬菌体的活力降低;当pH≥11时,噬菌体则处于失活状态(图4C),即该噬菌体在强酸、强碱的条件下无法存活.A,一步生长曲线;B,热敏感性;C,酸碱稳定性;D,杀菌效果A,OneGstepgrowthcurve;B,Thermalsensitivity;C,AcidGbasestability;D,Sterilizationeffect图4噬菌体vB_EcoM_BP10的生物学特性分析Fig.4BiologicalcharacteristicsofphagevB_EcoM_BP10中国畜牧兽医8532.8噬菌体的杀菌效力通过将噬菌体与宿主菌共培养测定D600nm值的方法来评估噬菌体的杀菌效力.根据试验结果可知,当MOI=0(即阴性对照),在5h内D600nm值随着时间的延长不断升高,宿主菌能迅速复制并保持在较高的浓度范围内.当在培养液中加入MOI为0.1和1的噬菌体时,D600nm值在30min内有短暂上升的趋势.一段时间后,随着噬菌体的快速繁殖,D600nm值迅速下降,表明噬菌体能显著抑制细菌繁殖,且杀菌效果明显(图4D).相较于MOI=0.1时,MOI=1的杀菌效果更为显著.2.9噬菌体全基因组测序经测序数据结果分析可知,噬菌体vB_EcoM_BP10基因组总片段长度为52288bp,GC含量为44.16%.该基因组共编码71个以ATG为起始密码子的ORF.其中ORF14由72个氨基酸组成,为最小的编码区.由1242个氨基酸构成长为3726bp的ORF23为最大的阅读框.通过全基因组RAST在47卷线初步注释和NCBI的BLASTP分析,仅有4366%的ORF为推定或已证实功能的蛋白,超过半数以上的蛋白均为假想蛋白(图5).由表4可知,多种酶共同调控噬菌体DNA的复制,如ORF3编码核酸外切酶(exonuclease)、ORF5DNA连接酶(DNAligase)、ORF70DNA聚合酶(DNApolymerase).因此,噬菌体vB_EcoM_BP10具有整套管控遗传物质呈递的酶系统.为维持噬菌体完整的形态和结构特征,ORF27调控基板组装蛋白(baseplateassemblyprotein),ORF9组成大亚基端(largesubunitterminase),ORF11编码门户蛋白(portalprotein),ORF23和ORF33共同构成尾丝纤维蛋白(tailfiberprotein).噬菌体发挥裂解细菌的作用,主要依靠穿孔素和内溶素(endolyGsin),ORF功能预测结果也印证了这一点,其中ORF34为穿孔素(holin),OEF35和ORF56为分别位于噬菌体中部和尾部的两个内溶素.图5噬菌体vB_EcoM_BP10全基因图Fig.5CompletegenemapofphagevB_EcoM_BP10表4噬菌体vB_EcoM_BP10部分ORF功能预测Table4ORFfunctionpredictionofthephagevB_EcoM_BP10genome开放阅读框氨基酸数量开放位置阅读框PositionofORFORF/bpORF3937-1827ORF41839-2363ORF52449-3108ORF63275-3727登录号Numberofaminoacids/个296174219150相关蛋白描述HitdescriptionAccessionNo.E值EvalueYP001595435.1putative5′G3′exonuclease[a]ABR68752.194.592.10EG167YP001595436.1phageprotein[a]ABR68753.198.289.80EG96YP001595437.1putativeDNAligase[a]ABR68754.194.064.10EG123YP001595438.1phageprotein[a]ABR68755.195.334.50EG81相似度Identity/%韦德源等:产志贺毒素多重耐药大肠杆菌噬菌体的生物学特性及全基因组分析953续表2期开放阅读框开放阅读框氨基酸数量位置PositionofORFORF73730-4251ORFNumberofaminoacids/个173登录号AccessionNo.相关蛋白描述HitdescriptionABR68778.1ABR68760.1ORF94854-6899681otidylhydrolase[a]ABR68756.1YP001595439.1putativedeoxyuridine5′GtriphosphatenucleGYP001595443.1putativelargesubunitterminase[a]YP001595445.1putativeportalprotein[a]ABR68762.1YP007004717.1gp67[b]AEJ81443.1YP001595448.1majorcapsidprotein[a]ABR68765.1YP001595450.1phageprotein[a]ABR68767.1YP001595453.1phageprotein[a]ABR68770.1YP001595454.1phageprotein[a]ABR68771.1YP001595459.1phageprotein[a]ABR68776.1YP001595461.1putativebaseplateassemblyprotein[a]YP001595462.1phageprotein[a]ABR68779.1YP001595463.1phageprotein[a]ABR68780.1YP001595464.1phageprotein[a]ABR68781.1YP001595466.1phageprotein[a]ABR68783.1YP001595467.1putativetailfiberprotein[a]ABR68784.1YP001595468.1putativeholin[a]ABR68785.1YP001595469.1putativeendolysin[a]ABR68786.1YP001595470.1ribonucleotidereductasebetasubunit[a]YP001595396.1RNApolymerase[a]ABR68713.1YP001595410.1putativesingleGstrandedDNAGbindingproGYP001595416.1putativeendolysin[a]ABR68733.1YP001595417.1putativeantirestrictionprotein[a]YP001595426.1phageprotein[a]ABR68743.1YP001595428.1putativethymidylatesynthase[a]YP001595430.1helicase/primase[a]ABR68747.1YP001595432.1DNApolymerase[a]ABR68749.1438ORF117114-8430ORF1410021-1023972ORF1510295-11302335ORF1711790-12179129ORF2013048-14496482ORF2114507-14962151ORF2315592-193171241YP001595457.1putativetailfiber[a]ABR68774.1ORF2520500-21387295ORF2721862-22533223ORF2822533-22904123ORF2922931-24037368ORF3024039-24680213ORF3225829-27202457ORF3327212-28249345ORF3428257-28598113ORF3528616-29170184ORF3629170-30270366ORF3730988-33102704ORF5237633-38010125ORF5640018-40323101ORF5840675-41157160ORF6645293-4552978ORF6847038-47688216ORF6947689-49455588ORF7049542-51455637[a]:EnterobacteriaphagephiEcoMGGJ1;[b]:ErwiniaphagevB_EamMGY22.10噬菌体基因组GO功能注释根据GO数据库分析,噬菌体vB_EcoM_BP10中共有29个基因在生物进程(biologicalprocess)和分子功能(molecularfunction)中得到注释(图6),tein[a]ABR68727.1ABR68734.1ABR68745.1ABR68787.1相似度Identity/E值Evalue%95.935.50EG9199.850098.865.60EG24972.224.90EG1795.825.70EG18595.352.40EG6791.701.80EG24897.351.10EG7975.4096.271.10EG15297.311.40EG12398.375.90EG6392.123.60EG19689.674.40EG10661.241.30EG15070.312.40EG13097.351.00EG5396.202.50EG9791.404.30EG19491.6786.613.10EG5192.083.90EG5281.882.80EG7398.722.90EG3197.691.30EG12195.0699.06000其中各条目主要参与到小分子代谢(smallmoleculemetabolic)、细胞氮化合物代谢(cellularnitrogencompoundmetabolic)、生物合成(biosyntheticprocess)等生物学过程中;具备核苷酸转移酶活性063(nucleotidyltransferaseactivity)、离子结合(ionbinding)、DNA结合(DNAbinding)等分子功能.中国畜牧兽医47卷噬菌体vB_EcoM_BP10在GO数据库中并没有得到相关细胞组分的注释.图6噬菌体vB_EcoM_BP10的GO功能注释图Fig.6GOfunctionalannotationofphagevB_EcoM_BP102.11噬菌体遗传进化分析通过NCBI的BLAST与Easyfig软件比对分析可知,噬菌体vB_EcoM_BP10与EscherichiaphageST32,completegenome(MF04458.2)的同源性最高,相同基因覆盖率可达93.95%;其次为EnGterobacteriaphagephiEcoMGGJ1,completegenome(EF460875.1),且这些噬菌体位于同一分支上,具有较近的亲缘关系(图7).图7噬菌体vB_EcoM_BP10全基因组比对Fig.7CompletegenomealignmentofphagevB_EcoM_BP103讨论近年来,STEC菌株因高致病力受到学者们的普遍关注,在世界各地的分离率居高不下[18].在治疗中,抗生素作为治疗STEC的首选,但随着抗生素的广泛使用,导致细菌对抗生素产生巨大的抗性,效果不理想,增加生产的成本.噬菌体作为一种优良的抗菌剂,具有高度特异性,可快速杀灭宿主菌,高度特异性且不会产生副作用的特点逐渐进入了研且不易产生耐药性,也易获取.噬菌体对宿主菌的究领域[19],通过对噬菌体生物学特性的研究和全基因组分析,可为噬菌体的进一步开发利用提供依据.在本研究中宿主菌GXEC010同时具备毒力基因与多重耐药抗性,相较于陈义宝等[20]分离的噬菌体vB_EcoM_PHB05(潜伏期10min,基因组片段韦德源等:产志贺毒素多重耐药大肠杆菌噬菌体的生物学特性及全基因组分析2期147659bp)而言,噬菌体vB_EcoM_BP10的宿主菌背景更复杂,潜伏期为5min,基因组片段为52288bp,能更好地适应外界环境的改变.与王冉等[21]分离鉴定的产肠毒素大肠杆菌(ETEC)噬菌体PK88G4相比(爆发期40min,爆发量40),本研究中的噬菌体vB_EcoM_BP10爆发期65min,裂解量51,杀菌能力更强.噬菌体vB_EcoM_BP10的生物特性测定表明,该噬菌体对温度和酸碱度都有较广的适应范围.温度在30~60℃之间还可保持活性,对宿主菌具有较强的感染性.这对作为生物制剂研制和加工来说极有利,可避免在开发中失效.在pH5~8之间都可保持较高的活性,作为消毒剂的开发使用,可在不同的酸碱环境中起作用,活性不会降低,该噬菌体的体外杀菌试验表明,经过3h后,D600nm值维持在0.1以下,而且没有升高,说明噬菌体vB_EcoM_BP10杀菌效果明显且稳定.因此,噬菌体vB_EcoM_BP10具有成为生物制剂的潜力和更加广阔的应用前景.噬菌体主要通过“穿孔素-内溶素”裂解系统发挥对细菌增殖的抑制作用[22G25].本研究中,噬菌体vB_EcoM_BP10的ORF34编码穿孔素,ORF35和ORF56为分别位于噬菌体全基因组中段和尾部的两个内溶素,表明其同时表达两种蛋白介导宿主细菌的裂解.与噬菌体vB_EfaP_IME195的ORF16被鉴定为噬菌体裂解素,ORF19编码穿透细菌细胞膜的孔蛋白不同.本研究中噬菌体vB_EcoM_BP10共含有两个内溶素且位置距离较远,故推测内溶素的数量和位置可能与噬菌体的裂解能力有关.4结论本研究中噬菌体vB_EcoM_BP10噬菌斑透亮,无晕圈,属肌尾科噬菌体,具有清晰的宿主受体特异性;在30~60℃可保持较高活性,可在pH5~8保持稳定;最佳MOI为1,感染宿主菌的潜伏期为5min,爆发期持续65min,裂解量51;该噬菌体能在短时间内将宿主菌杀灭,MOI=1时,经过3h的作用D600nm值在0.1以下.本研究结果将为噬菌体作为生物制品的开发应用奠定理论基础.参考文献(References):[1]COLELLOR,ETCHEVERRÍAAI,CONZAJAD,etal.AntibioticresistanceandintegronsinShigatoxGinGproducingEscherichiacoli(STEC)[J].BrazilianJournalofMicrobiology,2015,46(1):1G5.163[2]GYLESC.ShigatoxinGproducingEscherichiacoli:Anoverview[J].JournalofAnimalScience,2007,85(suppl_13):E45GE62.[3]CABALA,PORREROMC,CRUZMLDL,eta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