树鼩脊髓微血管内皮细胞的分离培养及EV71感染实验
【摘要】 目的建立树鼩脊髓来源的微血管内皮细胞体外分离培养技术，用71型肠道病毒（enterovirus71，EV71）感染该细胞，探讨其感染特性，为EV71损伤中枢神经系统机制的研究提供基础。方法采用Ⅱ型胶原酶、分散酶、DNaseⅠ三酶联合两次消化树鼩脊髓组织后，获取微血管内皮细胞，并进行纯化和鉴定。用EV71感染树鼩脊髓微血管内皮细胞，测定感染不同时间点的细胞及其培养上清液中病毒载量。采用间接免疫荧光法检测细胞中EV71标志蛋白的表达，以确定EV71对树鼩脊髓微血管内皮细胞的感染性。结果分离培养获得的树鼩脊髓微血管内皮细胞呈典型的分支状和串珠状，经过嘌呤霉素纯化培养后的传代细胞主要是不规则的多角状细胞；细胞免疫荧光鉴定结果显示，微血管内皮细胞标志蛋白CD31和血管性血友病因子（vonWillebrandfactor，vWF）表达都呈阳性。用感染复数为1的EV71感染树鼩脊髓微血管内皮细胞，可见典型的细胞病变，且病毒滴度可达3.2×106TCID50/mL，表明EV71可成功感染树鼩脊髓微血管内皮细胞并有效增殖；而且在48h内，细胞培养上清液中病毒载量呈线性升高，而细胞中病毒载量在12h到达顶
