野山参和园参对术后疲劳综合征大鼠骨骼肌炎症反应的影响
【摘要】 目的探讨野山参和园参对术后疲劳综合征鼠骨骼肌炎症反应的作用。方法48只大鼠随机分为对照组、模型组、园参组和野山参组，每组12只。术后1、3d，抓力试验检测骨骼肌功能;术后3d，荧光RT⁃PCR法检测促炎因子mRNA水平，Westernblot法检测腓肠肌炎症和萎缩相关蛋白表达，HE染色法观察骨骼肌形态。结果术后3d与模型组比较，园参组大鼠最大抓力显著增强（P<005），腓肠肌IL⁃1β、TNF⁃αmRNA表达及p⁃p38、p⁃NF⁃κB、atro⁃gin⁃1、Murf⁃1蛋白表达显著降低（P<005）;与模型组比较，野山参组大鼠最大抓力显著增强（P<005），腓肠肌IL⁃1β、TNF⁃αmRNA及p⁃p38、p⁃NF⁃κB、atrogin⁃1、Murf⁃1蛋白表达显著降低（P<005）;与园参组比较，野山参组大鼠最大抓力增强（P<005），腓肠肌TNF⁃αmRNA表达及Murf⁃1蛋白表达显著降低（P<005）。HE染色结果显示，对照组肌纤维束直径较宽，肌束间隙紧密;模型组肌纤维束直径较小，肌束间隙较宽;园参组和野山参组肌纤维束形态较模型组得到改善。结论野山参和园参改善了术后疲劳综合征大鼠的骨骼肌炎症反应，且野山参效果优于园参。关键词:野山参;园参;术后疲劳综合征;骨骼肌;炎症反应中图分类号:R2855doi:103969/j.issn.1001⁃1528201905039术后疲劳综合征是外科手术后恢复期主要和常见的并发症之一，大多发于心脏及腹部大手术后，严重影响患者术后康复和生活质量，常出现肌肉无力、失眠、注意力不集中、情绪低落、焦虑等表现[1⁃2]。人参为五加科植物人参PanaxginsengC.A.Mey.的干燥根，具有补气、固脱、生津、安神、益智等疗效，而园参为人工栽培的人参[3]，野山参为把人参种子撒播到深山密林中自然生长15年以上者，即为2015年版《中国药典》中人参项下生长年份达15年以上的“林下山参”。人参皂苷是评价人参内在质量的重要指标，并且林下参总皂苷含有量高于园参[4]，课题组前期建立了术后疲劳综合征大鼠模型[5]，发现人参皂苷具有抗疲劳、改善中枢炎症的作用[6⁃7];本实验采用人参改善术后疲劳综合征大鼠的骨骼肌炎症，进一步改善术后疲劳，并比较野山参与园参的治疗效果。1材料11动物SPF级雄性SD大鼠48只，6~8周龄，体质量210~230g，由上海西普尔⁃必凯实验动物有限公司提供，实验动物许可证号SCXK（沪）2013⁃0016，饲养于上海市第十人民医院中心实验室屏障环境中，给予标准饲料和饮用水，适应性喂养1周后进行试验。12试剂野山参粉、园参粉购自上海上药神象健康药业有限公司，批号分别为150917、150921。p38抗体（批号8690）、p⁃p38抗体（批号4631）、NF⁃κB抗体（批号8242）、p⁃NF⁃κB抗体（批号3033）均购自美国CST公司;atrogin⁃1抗体（批号ab168372）、Murf⁃1抗体（批号ab172479）、α⁃tubulin抗体（批号ab52866）均购自英国Abcam公司;辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔二抗（批号BL003A）购自Biosharp公司;ECL发光液（批号34096）购自美国ThermoFisher公司;RIPA蛋白裂解液（批号P0013B）购自上海碧云天生物技术有限公司;戊巴比妥钠（批号P3761）购自美国Sigma公司;RT试剂盒（批号RR037A）购自日本Takara公司;SYBRGreenPCR试剂盒（批号KK4601）购自美国Kapabiosystems公司;Trizol（批号15596018）购自美国Invitrogen公司;通用性组织固定液（批号G1101），购自武汉赛维尔生物科技有限公司。13仪器实时荧光定量PCR仪（美国ABI公司，型号7900）;台式低温离心机（美国Eppendorf公司，型号5415R）;全自动样品快速研磨机（上海净信科技公司，型号JXFSTPRP⁃12/16）;多功能酶标仪（美国BioTek公司，型号Synergy2）;超低温冰箱（美国ThermoFisherScientific公司，型号900）;超灵敏多功能成像仪（绿绵科技有限公司，型号Amershamimager600）;大小鼠抓力测试仪（江收稿日期:2018⁃07⁃05基金项目:国家自然科学基金资助项目（81770884）;上海市中西医结合学会基金项目（shcim201701）作者简介:范圣东（1992-），男，硕士，研究方向为胃肠外科临床营养。Tel:13817424972，E⁃mail:1530300695@qq.com∗通信作者:余震（1966-），男，教授，博士生导师，研究方向为普通外科及临床营养支持。Tel:18917687560，E⁃mail:7411yuzhen0577@163.com中成药ChineseTraditionalPatentMedicineMay2019Vol.41No.52019年5月第41卷第5期苏赛昂斯生物科技有限公司，型号DS2⁃20N）。2方法21分组及造模48只大鼠采用随机数字表法分为对照组、模型组、园参组、野山参组，每组12只，对照组大鼠开腹后仅翻动肠袢，模型组、园参组和野山参组大鼠采用70%中段小肠切除法制备术后疲劳综合征大鼠模型[5]。22给药野山参组大鼠按体质量从术前3d开始每天灌胃给予1mL/100g药材细粉悬液（双蒸水配制成75mg/mL，现配现用），园参组大鼠同法灌胃药材粉悬液，术后灌胃等剂量人参悬液，对照组、模型组大鼠于每天相同时间灌胃等体积双蒸水，1次/d，直至术后3d。23取材于术后3d，大鼠腹腔注射2%戊巴比妥钠（35mL/kg）麻醉，生理盐水灌注后迅速取出腓肠肌组织，4℃预冷生理盐水中清洗干净，滤纸吸干，液氮储存待测。生理盐水灌注后，继续灌注4%多聚甲醛溶液约150mL进行活体固定，迅速取出腓肠肌组织，置于组织固定液中继续固定。所有灌注液于4℃下预冷。24指标检测241抓力实验利用抓力测定仪检测大鼠最大抓力。仪器水平放置后，将大鼠轻轻地放在抓力板上，抓住鼠尾轻轻向后牵拉，待大鼠抓牢抓力板后均匀用力后拉直至大鼠松爪，此时仪器会自动记录大鼠最大抓力，重复5次，每次30s，取最大值作为最大抓力。各组大鼠分别于术前进行适应性训练及术后1、3d进行测定。242炎症因子mRNA表达采用实时荧光定量PCR法。取大鼠腓肠肌组织50mg，按照Trizol法抽提总RNA，内参基因选择GAPDH，以相对表达量表示mRNA表达，引物由上海生工科技有限公司设计合成。其中，IL⁃1β正向5`AACTGTGAAATAGCAGCTTTCG3`，反向5`CTGT⁃GAGATTTGAAGCTGGATG3`;IL⁃6正向5`TGCACTGT⁃CAGAAAACAATCTG3`，反向5`CCAGAGCAGATTTTCAAT⁃AGGC3`;TNF⁃α正向5`GCATGATCCGAGATGTGGAACTGG3`，反向5`CGCCACGAGCAGGAATGAGAAG3`;GAPDH正向5`GGCAGAATGTCTTGTGAGAGC3`，反向5`CCCATACCCACCATCACACC3`。25腓肠肌炎症、萎缩相关蛋白表达检测采用Westernblot法。取大鼠腓肠肌组织25mg，加入RIPA蛋白裂解液提取蛋白，标准曲线计算出蛋白浓度，测定上样量，10%SDS⁃PAGE胶分离，电转至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，5%脱脂牛奶封闭1h，加入稀释好的一抗，4℃过夜，PBST清洗3次后，加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG室温孵育1h，PBST清洗3次，加入ECL发光液显色曝光。扫描获取图像后，利用软件进行灰度值分析。26骨骼肌形态从组织固定液中取出固定好的腓肠肌样本，进行常规脱水，浸蜡，包埋，切片，进行HE染色，光学显微镜下观察腓肠肌形态变化。27统计学分析通过SPSS220软件进行处理，数据以（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析（One⁃way⁃8411ANOVA）。P<005差异具有统计学意义。3结果31大鼠最大抓力表1显示，术后1d，各组大鼠最大抓力无显著差异（P>005）。术后3d与对照组比较，模型组大鼠最大抓力显著降低（P<005）;与模型组比较，园参组、野山参组大鼠最大抓力显著增强（P<005）;与园参组比较，野山参组大鼠最大抓力显著增强（P<005）。表1各组大鼠最大抓力比较（g，x±s，n=12）组别术后1d104567±907597142±999599625±10270102250±11260术后3d123800±9821100583±9237∗111350±6381△120608±7715△▲对照组模型组园参组野山参组注:与对照组比较，∗P<005;与模型组比较，△P<005;与园参组比较，▲P<00532IL⁃1β、IL⁃6、TNF⁃αmRNA表达图1显示，术后3d与对照组比较，模型组IL⁃1β、IL⁃6和TNF⁃αmRNA表达显著增强（P<005）;与模型组比较，园参组、野山参组IL⁃1β、TNF⁃αmRNA表达显著降低（P<005）;与园参组比较，野山参组TNF⁃αmRNA表达显著降低（P<005）。图1各组IL⁃1β、IL⁃6、TNF⁃αmRNA表达比较注:与对照组比较，∗P<005;与模型组比较，△P<005;与园参组比较，▲P<00533p⁃p38、p⁃NFκB、atrogin⁃1、Murf⁃1蛋白表达比较图2显示，术后3d与对照组比较，模型组p⁃p38、p⁃NF⁃κB、atrogin⁃1、Murf⁃1蛋白表达显著升高（P<005）;与模型组比较，园参组、野山参组四者蛋白表达在降低（P<005）;与园参组比较，野山参组Murf⁃1蛋白表达显著降低（P<005）。2019年5月第41卷第5期中成药ChineseTraditionalPatentMedicineMay2019Vol.41No.5注:与对照组比较，∗P<005;与模型组比较，△P<005;与园参组比较，▲P<005图2各组p⁃p38、p⁃NFκB、atrogin⁃1、Murf⁃1蛋白表达比较34大鼠腓肠肌HE染色图3显示，对照组大鼠肌纤维束饱满，直径较宽，肌束间隙紧密;模型组大鼠肌纤维束较纤细、萎缩，直径较小，肌束间隙较宽;园参组、野山参组大鼠肌纤维束形态较模型组得到改善。注:与对照组比较，∗P<005;与模型组比较，△P<005图3各组大鼠腓肠肌HE染色（×100）4讨论研究表明，骨骼肌肌力下降和术后疲劳综合征发生有一定关系[8]。本实验通过抓力试验对大鼠最大抓力进行检测，以评价大鼠骨骼肌功能，从而间接反映术后疲劳状况，发现与对照组比较，模型组大鼠最大抓力明显下降，表明大鼠进行了70%中段小肠切除术后骨骼肌肌力下降，存在明显的疲劳感;园参、野山参干预后，大鼠最大抓力有所提高，改善了术后疲劳。腹部大手术作为1种巨大应激，可导致全身广泛炎症反应，Witasp等[9]报道手术期间骨骼肌中编码炎症蛋白（如IL⁃6、TNF⁃α）mRNA的表达增加，本实验发现，术后疲劳综合征大鼠在术后第1天腓肠肌IL⁃1β、IL⁃6、TNF⁃αmRNA表达升高;也有证据表明手术创伤产生的肌肉水平炎症会诱导肌肉蛋白质降解[10]。磷酸化的p38是NF⁃κB重要的正向信号，并且后者激活可使MuRF⁃1、atrogin⁃12个E3泛素连接酶表达增高，加速蛋白质分解，造成肌肉萎缩[11⁃12]，本实验发现大鼠在术后第3天腓肠肌p⁃p38、p⁃NF⁃κB、atrogin⁃1、Murf⁃1蛋白表达升高，表明在手术早期9411中成药ChineseTraditionalPatentMedicine2019年5月第41卷第5期激活了炎症信号通路，使肌肉蛋白质代谢发生一定变化，影响了骨骼肌功能;形态学结果显示，大鼠肌纤维束较纤细，直径较小，肌束间隙较宽，提示术后早期在肌肉水平产生了炎症，对骨骼肌损伤修复造成了一定影响。人参具有十分广泛的药理活性，如抗氧化、抗炎、增强体力、抗疲劳、调节物质代谢等功效[13⁃14]。园参、野山参干预后，大鼠腓肠肌炎症因子mRNA表达水平降低及p⁃p38、p⁃NF⁃κB、atrogin⁃1、Murf⁃1蛋白表达降低，骨骼肌功能有所好转，提示两者有抗炎作用，并在一定程度上改善了术后疲劳;与园参组比较，野山参组大鼠各项炎症指标均有不同程度降低，疗效更好，骨骼肌功能恢复也更快，表明野山参在骨骼肌抗炎效果上优于园参，更有利于改善术后疲劳，加速术后康复，其原因可能是该药材在接近野生的环境中生长，周期更长，更有利于其功效成分累积和多种独特化学成分形成。综上所述，园参和野山参在一定程度上抑制了术后疲劳综合征大鼠骨骼肌内炎症反应，改善了其损伤修复能力，从而减轻术后疲劳。参考文献:[1]ChristensenT，KehletH.Postoperativefatigue[J].WorldJSurg，1993，17（2）:220⁃225.[2]OliveiraM，OliveiraG，Souza⁃TalaricoJ，etal.Surgicaloncolo⁃gy:evolutionofpostoperativefatigueandfactorsrelatedtoitsse⁃verity[J].ClinJOncolNur，2016，20（1）:E3⁃E8.[3]国家药典委员会.中华人民共和国药典:2015年版一部[S].北京:中国医药科技出版社，2015:8.[4]何绍玉，李伟，郑毅男，等.林下山参与园参中腺苷和人参皂苷含量比较分析[J].药物分析杂志，2010，30（9）:1701⁃1706.[5]ZhangXD，ChenBC，DongQT，etal.Establishmentandas⁃May2019Vol.41No.5sessmentsofanewmodelforthepostoperativefatiguesyndromebymajorsmallintestinalresectioninrats[J].ScandJGastroen⁃terol，2011，46（11）:1302⁃1309.[6]ZhuangCL，MaoXY，LiuS，etal.GinsenosideRb1improvespostoperativefatiguesyndromebyreducingskeletalmuscleoxi⁃dativestressthroughactivationofthePI3K/Akt/Nrf2pathwayinagedrats[J].EurJPharmacol，2014，740:480⁃487.[7]刘舒，吕金晓，郑蓓诗.人参皂苷Rb1改善术后疲劳综合征大鼠中枢炎症反应的机制研究[J].中草药，2015，46（14）:2104⁃2110.[8]ChristensenT，WulffC，Fuglsang⁃FrederiksenA，etal.Electri⁃calactivityandarmmuscleforceinpostoperativefatigue[J].ActaChirScand，1985，151（1）:1⁃5.[9]WitaspA，NordforsL，SchallingM，etal.Increasedexpressionofinflammatorypathwaygenesinskeletalmuscleduringsurgery[J].ClinNutr，2009，28（3）:291⁃298.[10]VaradhanKK，Constantin⁃TeodosiuD，ConstantinD，etal.In⁃flammation⁃mediatedmusclemetabolicdysregulationlocalandremotetothesiteofmajorabdominalsurgery[J].ClinNutr，2017，5614（17）:31393⁃31396.[11]KimHJ，LeeHS，ChongYH，etal.p38Mitogen⁃activatedproteinkinaseup⁃regulatesLPS⁃inducedNF⁃κBactivationinthedevelopmentoflunginjuryandRAW2647macrophages[J].Toxicology，2006，225（1）:36⁃47.[12]ArgilésJM，López⁃SorianoFJ，BusquetsS.Musclewastingincancer:theroleofmitochondria[J].CurrOpinClinNutrMetabCare，2015，18（3）:221⁃225.[13]ShergisJL，ZhangAL，ZhouW，etal.Panaxginsenginran⁃domisedcontrolledtrials:asystematicreview[J].PhytotherRes，2013，27（7）:949⁃965.[14]谈善军，余震，董千铜，等.人参皂苷Rb1对术后疲劳综合征大鼠骨骼肌氧化应激的影响[J].中国中西医结合杂志，2012，32（11）:1535⁃1538.0511
