铝和铜长期暴露对林蛙幼虫生长发育的影响
【摘要】 本研究旨在评估林蛙幼虫暴露在不同水平的铝和铜环境下对其死亡率、阶段发育所需时间以及重量的影响。将孵化后48 h的林蛙幼虫暴露于10、100、500、1000和2000 μg/L铝或1、10、50、100和200 μg/L铜，对照组林蛙幼虫饲养在自来水中。在整个幼体发育期间，对死亡率、畸形、达到特定发育阶段的时间、这些阶段的体重进行评估。除200 μg/L铜组死亡率达到33.22%外，其他处理组死亡率均小于10%。与对照组相比，2000 μg/L铝水平组显著降低了孵化后20 d林蛙幼虫重量（P<0.05）。与铝的作用相反，50、100和200 μg/L铜组孵化后20 d林蛙幼虫重量显著低于对照组（P<0.05），而100 μg/L同组前肢发育阶段的幼虫重量显著低于对照组（P<0.05）。与对照组相比，50、100和200 μg/L铜水平组显著提高后腿发育、前肢发育及成尾吸收所需的时间（P<0.05），而10 μg/L铜组较对照组显著提高了林蛙幼虫前肢发育和成尾吸收所需时间（P<0.05），2000 μg/L铝水平组林蛙幼虫后腿发育、前腿发育及成尾吸收所需时间显著提高（P<0.05）。结论:本研究结果发现，铝和铜会影响林蛙幼虫的生长和发育，但铜的影响需要环境铜水平达到一定浓度。[关键词]铜;铝;林蛙幼虫;生长发育[中图分类号]X503.2[文献标识码]A[文章编号]1004-3314(2021)12-0005-04长期暴露于有毒环境（如重金属）使全球两栖类种群数量逐渐下降。铝是一种对两栖动物种群可能具有特殊意义的金属，特别是在因酸沉积或矿井排水而遭受酸化的地区。大多数关于铝对两栖动物影响的实验室调查都集中在短期内铝对两栖动物的影响，如胚胎或刚孵出幼虫的存活率（Skei和Dolmen，2006）。虽然铜的浓度比铝低得多，但在两栖类动物水生栖息地中经常存在铜（张旭等，2016）。虽然环境中的铜浓度通常远低于对两栖动物产生不利影响的水平，但由于人类活动导致的环境浓度升高，这种金属的风险变得越来越高，同时铜的毒性会在酸化环境中提高（Lance等，2012）。与铝的情况一样，大多数涉及铜的实验室研究都仅在短期暴露阶段（Garcia-Munoz等，2010）。与大多数实验室毒性研究的短期性质不同，在自然环境中，两栖动物通常在胚胎和幼虫发育的大部分或全部阶段都暴露在亚致死浓度的金属中（Hopkins和Rowe，2010）。因此，越来越多的人认识到，如果实验室研究适用于自然种群，这些调查必须评估两栖动物长期暴露于环境现实水平的金属浓度时的反应。除了评估长期暴露对变态期适应相关特征的影响外，重要的是要认识到金属的亚致死影响可能在变态完成前的发育阶段有不同的表现。本研究探讨了在整个幼体期暴露于铝和铜的不良影响中。具体来说，这项研究的目的是检验铝和铜的浓度对存活率、达到特定发育阶段的时间以及各阶段体重的影响。1材料与方法1.1试验动物与金属暴露收集林蛙的卵团（约250个），将卵团放置在单独的57L水族箱中，水温为23℃，pH为4.70。所有胚胎在收集后48h内孵化，孵化后所有幼虫都被放入一个普通的285L的容器中，将每个卵群中的个体混合。再将每个处理的林蛙幼虫（约27条）放置在含有10、100、500、1000和2000μg/L铝或1、10、50、100和200μg/L铜的2.5L玻璃缸中。对照组单独饲养在盛有自来水的碗中，实验使用的所有自来水在使用前都通48h氧气，使用硝酸将pH调节到6中国饲料2021年第12期4.70。各组水质参数见表1。表1不同水平铜和铝暴露组林蛙幼虫水化学参数电导率/mV温度/℃硬度/（mg/L碳酸钙）117.6±6.8114.4±3.74.69±0.0623.1±0.1pH项目对照组铝/（μg/L）1010050010002000铜/（μg/L）110501002004.68±0.074.68±0.064.70±0.064.69±0.064.71±0.104.71±0.14.70±0.094.69±0.104.68±0.084.69±0.09115.1±4.1114.9±4.8113.3±3.6114.1±3.7113.0±3.4113.0±3.4114.1±3.8114.2±4.0115.3±3.4113.9±3.723.2±0.123.2±0.223.2±0.223.1±0.123.2±0.123.2±0.123.2±0.223.1±0.223.1±0.123.2±0.2112.5±7.5119.5±9.1114.2±7.4116.4±9.4109.9±8.8116.1±8.3114.0±10.1111.0±8.9116.1±9.2109.2±9.81.2生物反应参考Unrine等（2004）描述的方法每天检查幼虫死亡情况，孵化后的天数被确定为完成后肢发育、前肢出现和成尾完全吸收。每个个体的质量是在每个阶段和孵化后20d完成。1.3统计分析各组试验结果采用SPSS软件多因素方差分析模型，分别对主效应（铜和铝水平）、阶段进行单因素分析，同时研究其交互效应，P<0.05表示差异显著。2结果与分析2.1不同水平铜和铝对林蛙幼虫死亡率及重量的影响由表2可知，整个试验期间所有存活的幼虫均成功完成变态发育，铝处理组幼虫的死亡率均在10%以下，且都无显著差异（P>0.05），但200μg/L铜水平组林蛙幼虫在前肢发育时死亡率达到33.22%。总体而言，铝暴露水平对各阶段林蛙幼虫重量的影响无显著差异（P>0.05），但铝水平和阶段对林蛙幼虫重量的影响具有显著交互效应（P<0.05）。与对照组相比，2000μg/L铝水平组显著降低了孵化后20d林蛙幼虫重量（P<0.05）。与铝的影响相反，铜暴露浓度对林蛙幼虫各发育阶段重量均具有显著影响（P<0.05），其中50、100和200μg/L铜组孵化后20d林蛙幼虫重量显著低于对照组（P<0.05），而100μg/L同组前肢发育阶段的幼虫重量显著低于对照组（P<0.05）。2.2不同水平铜和铝对林蛙幼虫发育时间的影响由表3可知，与对照组相比，50、100和200μg/L铜水平组显著提高了后腿发育、前肢发育及成尾吸收所需的时间（P<0.05），而10μg/L铜组较对照组显著提高了林蛙幼虫前肢发育和成尾吸收所需时间（P<0.05）。此外，铝暴露水平对林蛙幼虫各阶段发育时间具有显著影响（P<0.05）。与对照组相比，2000μg/L铝水平组林表2不同水平铜和铝暴露对林蛙幼虫死亡率及重量的影响项目对照组铝/（μg/L）1010050010002000铜/（μg/L）11050100200死亡率/%后腿发育前肢发育009.89±0.134.78±0.289.86±0.350.95±0.304.80±0.22a0b0b0b0000000b0b0b0b8.23±0.35a33.22±6.78a孵化后20d0.48±0.12a0.45±0.13a0.44±0.12a0.46±0.12a0.47±0.16a0.38±0.11b0.37±0.10a0.40±0.08a0.32±0.04b0.34±0.09b0.30±0.03b平均重量/g后腿发育0.56±0.080.55±0.140.54±0.300.56±0.220.58±0.220.58±0.220.54±0.120.53±0.230.57±0.170.50±0.220.58±0.27前肢发育0.67±0.130.67±0.230.66±0.180.70±0.210.73±0.310.70±0.28a0.67±0.33a0.63±0.31a0.58±0.20ab0.56±0.13b0.64±0.24a成尾吸收0.48±0.120.48±0.330.52±0.280.50±0.170.52±0.160.50±0.160.53±0.240.49±0.130.54±0.210.48±0.100.49±0.30注:同列数据中分别用不同水平铜或铝与对照组比较，不同字母标注表示差异显著（P<0.05）。2021年第12期中国饲料表3不同水平铜和铝对林蛙幼虫几个发育阶段时间的影响项目/d对照组铝/（μg/L）1010050010002000铜/（μg/L）11050100200后腿发育29.89±3.43b31.12±4.5432.33±3.9832.55±2.9830.67±3.9338.78±4.34a32.33±3.65a33.42±4.54ab39.96±4.78a41.02±4.91a47.77±5.98a前肢发育46.15±5.32b47.87±6.7849.67±8.7849.87±7.8849.88±6.9255.50±7.03a49.87±5.67a51.12±7.12a56.12±7.83a61.13±8.56a70.88±10.02a成尾吸收52.24±6.78b54.34±7.8756.13±9.6755.67±8.7555.48±6.9859.89±9.12a57.02±6.87a59.87±5.91a63.23±8.12a70.13±8.02a76.05±10.45a7前肢出现-尾吸收4.89±0.45b6.96±1.02a6.95±0.97a6.96±0.94a7.13±0.89a7.15±0.92a蛙幼虫后腿发育、前腿发育及成尾吸收所需时间显著提高（P<0.05）。铝暴露水平对林蛙幼虫前肢出现-尾吸收的时间无显著影响（P>0.05，数据未列出）。但与对照组相比，所有铜暴露水平组林蛙幼虫前肢出现-尾吸收的时间显著延长（P<0.05）。3讨论在本研究中，林蛙幼虫从发育阶段暴露于铜或铜，直到变态完成，结果显示其对这些金属的致死作用相对不敏感，因为所有铝水平组的幼虫死亡率都小于10%，而200μg/L铜组死亡率达到33.22%。在试验过程中，未发现林蛙幼虫的摄食行为和采食量有差异。对铜和铝的观察效果，一个更合理的解释是，体重降低可能反映了暴露在铜和铝的林蛙幼虫需要分配更多的能量来维持基础代谢（Sparling，2003）。Snodgrass等（2004）报道，与未暴露的幼虫相比，暴露于含有多种金属的青蛙和林蛙在发育过程的3个阶段中体重均有所下降。本研究中，2000μg/L铝水平组显著降低了孵化后20d林蛙幼虫重量，铜暴露浓度对林蛙幼虫各发育阶段重量均具有显著影响，其中50、100和200μg/L铜组孵化后20d林蛙幼虫重量显著低于对照组，这一结果与Peles等（2012）的结果相似。尽管所有在实验中存活下来的幼虫最终都完成了蜕变，但暴露在金属环境中（尤其是铜）会使发育迟缓。林蛙幼虫的发育过程对铜更敏感，因为随着铜浓度的增加，各发育阶段完成所需的时间延长。由于在孵化后20d金属暴露对幼虫体重几乎没有影响，所以增加进入发育阶段的时间可能与能量需求的增加无关。但两栖动物的变态涉及多种生物化学和生理过程，可以通过金属暴露来改变，这可能在慢性暴露期间尤为重要，因为已经在两栖动物幼虫中发现了铜和铝的生物积累（Lance等，2012）。此外，接触铜等金属可能会导致在两栖动物变态过程中起重要作用的内分泌过程中断。虽然关于铜对两栖动物内分泌功能的影响知之甚少，但这种金属对鱼类神经内分泌过程的影响已被广泛报道（Handy，2003）。本研究发现，铜和铝使林蛙幼虫生物学反应中完全变态的时间增加。完成变态的平均时间增加了至少7d（10μg/L铜），最高增加29d（200μg/L铜），这一事实增加了由于在池中捕食或脱水而死的风险。延迟变态与其他可能降低适应度的因素有关，如成虫存活、繁殖力和首次生殖的时间（Relyea，2002）。此外，铜暴露组较对照组林蛙幼虫完成尾吸收的时间提高了2d，这一结果暗示会降低四肢发育，进而导致被捕食的风险增加。4结论本研究结果发现，铝和铜会影响林蛙幼虫的8中国饲料2021年第12期生长和发育，但铜的影响需要环境铜水平达到一定浓度。此外，还需要进一步探讨时间-铜铝剂量效应与林蛙生理、体重和发育变化的关系。[6]PelesJD，PistoleDH，MoffeM.Time-specificandpopulation-leveldifferencesinphysiologicalresponsesoffatheadminnows（Pimephalespromelas）andgoldenshiners（Notemigonuscrysoleucas）exposedtocopper[J].AquaticToxicology，2012，109:参考文献222~227.[1]张旭付卫强冯承莲.我国淡水中铜的水质基准及生态风险评[7]RelyeaRA.Localpopulationdifferencesinphenotypic估研究[J].环境工程，2016，5:156~160.plasticity:predatorinducedchangesinwoodfrogtadpoles[J].[2]Garcia-MunozE，GuerreroF，ParraG.IntraspecificandEcologicalMonographs，2002，72:77~93.interspecifictolerancetocoppersulphateinfiveIberianamphibian[8]SkeiJK，DolmenD.EffectsofpH，aluminum，andsoftwateronspeciesattwodevelopmentalstages[J].ArchivesofEnvironmentallarvaeofamphibiansBufobufoandTriturusvulgaris[J].CanadianContaminationandToxicology，2010，59:312~321.[3]HandyRD.Chroniceffectsofcopperexposureversusendocrinetoxicity:twosidesofthesametoxicologicalprocess?[J].ComparativeJournalofZoology，2006，84:1668~1677.[9]SnodgrassJW，HopkinsWA，BroughtonJ，etal.Species-specificresponsesofdevelopinganuranstocoalcombustionwastes[J].BiochemistryandPhysiologyPartA，2003，135:25~38.AquaticToxicology，2004，66:171~182.[4]HopkinsWA，RoweCL.Interdisciplinaryandhierarchical[10]SparlingDW.Areviewoftheroleofcontaminantsinapproachesforstudyingtheeffectsofmetalsandmetalloidsonamphibiandeclines[M].In:HandbookofEcotoxicology.，2nded.amphibians[M].In:EctoxicologyofAmphibiansandReptiles.，2ndLewisPublishers，BocaRaton，2003，1099~1128.ed.SETACPress，Pensacola，FL，2010，325~336.[5]LanceSL，EricksonMR，FlynnRW，etal.Effectsofchroniccopperexposureondevelopmentandsurvivalinthesouthern[11]UnrineJM，JagoeCH.Dietarymercuryexposureandbioaccumulationinsouthernleopardfrog（Ranasphenocephala）larvae[J].EnvironmentalToxicologyandChemistry，2004，23:leopardfrog（Lithobates[Rana]sphenocephalus）[J].Environmental2956~2963.ToxicologyandChemistry，2012，31:1587~1594.Effectsoflong-termexposuretoaluminumandcopperonthegrowthanddevelopmentofwoodfroglarva（Zhengzhouforestpark，Zhengzhou，HenanProvince450000，China）LIRui[Abstract]Thepurposeofthisstudywastoassesstheeffectsofexposuretodifferentlevelsofaluminumandcopperonthemortality，stagedevelopmenttime，andweightofwoodfroglarva.Woodfroglarvaafterhatching48hwereexposedto100，500，1000and2000μgofaluminumor1，10，50，100and200μgofcopper.Mortality，malformation，timetospecificdevelopmentalstages，andweightatthesestageswereassessedthroughoutlarvaldevelopment.Exceptthe200μg/Lcoppergroup，themortalityratewas33.22%，andtheothertreatmentgroupswerealllessthan10%.Comparedwiththecontrolgroup，the2000μg/Laluminumlevelgroupsignificantlyreducedtheweightofwoodfroglarva20daysafterhatching（P<0.05）.Incontrasttotheeffectofaluminum，thelarvalweightofthe50，100and200μg/Lcoppergroupswassignificantlylowerthanthatofthecontrolgrouponday20afterincubation（P<0.05），whilethewoodfroglarvaweightofthe100g/Lgroupintheforelimbdevelopmentstagewassignificantlylowerthanthatofthecontrolgroup（P<0.05）.Comparedwithcontrolgroup，50，100，and200μg/Lcopperlevelgroupsignificantlyimprovedthehindlegs，armsdevelopmentandintothetimeneededfortailabsorption（P<0.05），while10μg/Lcoppergroupthanthecontrolgroupsignificantlyimprovedthefroglarvaeforetimeneededfordevelopmentandintothetailabsorption（P<0.05），and2000μg/Laluminumlevelsetofwoodlarvaedevelopmentbydevelopment，forelegsandtailtimeneededforabsorptionincreasedsignificantly（P<0.05）.Conclusion:theresultsofthisstudyshowthataluminumandcoppercanaffectthegrowthanddevelopmentofwoodfroglarva，buttheinfluenceofcopperrequirestheenvironmentalcopperleveltoreachacertainconcentration.[Keywords]copper;aluminum;woodfroglarva;growthanddevelopment
