木犀草素通过MIEF1抗H9c2心肌细胞损伤的机制研究
【摘要】 研究木犀草素(iteo/n丄ut)抗H9c2心肌细胞损伤的作用及其机制。采用大鼠H9c2心肌细胞株，以1训阿霉素(doxorubicin,Dox)建立心肌细胞损伤模型，不同浓度Lut(5、10、20pM)进行干预。细胞增殖法(MTT)检测细胞活力。通过高通量转录组测序筛选Lut(20pM)改善H9c2心肌细胞损伤的靶点基因。利用分子克隆技术,将心肌细胞中线粒体延长因子1(mitochondrialelongationfactor1,MILF1)表达抑制，蛋白免疫印迹法#Westernblot)检测Lut对低表达MIEF1心肌细胞中MIEF1,SeO37位点磷酸化-Drp1(p-Drp1,SeO37),CaspaseD蛋白表达水平。与模型Dox组比较丄ut显著改善H9c2细胞活力(P<0.05)&Dox组与正常组进行比较得到3582个差异基因;Lut加Dox组与Dox组进行比较得到1981个差异基因。利用小干扰RNA(/JNA)技术成功构建低表达MIEF1心肌细胞,Westernblot结果显示，Lut能够增加低表达MIEF1心肌细胞中MIEF1、p-Drp1(SeO37)蛋白表达水平(P<0.05)，降低CaspaseD蛋白表达水平(P<0.05)。总之丄ut对H9c2心肌细胞的保护作用可能与促进MIEF1表达有关，本实验结果为Lut治疗阿霉素导致的心肌细胞损伤提供理论依据。关键词:木犀草素;转录组学;心肌细胞;线粒体延长因子1中图分类号:R966DOI:10.16333//.10010880.2020.5.014文献标识码:A文章编号:10010880(2020)5X820X6ResearchonthemechanismofluteolinagainstH9c2carCiomyocyteinjurythroughMIEF1SHIYou-gany,YANGRui,ZHANGYang,SUNChen-piny*,LIEShengofBreastSurgeri(IntegratedTraditionalandWesternMeeicine),LonghuahospitalaffiliatedtoShanghaiunPefPacPeradiponalChinesemegicine,ShanghaiC00032,ChinaAbterace:Tosiudyiheefeciandmechanismofeuieoein(Lui)onH9c2myocaediaeceeiniuey.TheeaiH9c2myocaediaeceelinewasusedtoestablishamyocardialcellinjuomodelwith1pMdoxorubicin(Dox).DiderentconcentrationsofLut(5,10,20pM)wereusedforintervention.CellviabilitywasmeasuredbyMTTassay.High-throughputWanscVptomesequencingwasusedtoscreenthetargetgenesofLut(20pM)foridpovingH9c2myocardialcellinjuo-TheextendmyocardialcellmitochondriaFactor1(mitochondrialelongationfactor1,MIEF1)expressionwassuppressedbyusemolecularcloningtechnology-WesternblotwaspeiormedtodetecttheexpressionlevelsofMIEF1,phosphorylated-Drpl(p-Drp1,SeO37),andCaspaseDinmyocyteswithlowMIEF1expressionbyLut.ComparedwithDoxgroup,LutsignificanOyiepovedthecellviabilityofH9c2(P<0.05).3582didemntiaXyexpressedgeneswerefoundinDoxgroupcomparedwiththenormalgroup.1981didemntiaXyexpressedgeneswereobtainedinLutplusDoxgroupcomparedwithDoxgroup.SmallinterferingRNA(siRNA)wasusedtointefeowiththeconstructionofMIEF1lowexpressioncardiomyocytes.Westernblotresultsshowedthat,LutincreasedtheexpressionlevelofMIEF1andp-Drp1(SeO37)proteininmyocyteswithlowexpressionofMIEF1(P<0.05)anddecreasedtheexpressionlevelofCaspaseA(P<0.05).Inconclusion,theprotectivee/ectofLutonH9c2caediomyocytesmaybeeeeatedtothepeomotionofMIEF1eypeesion,theeesuetsofthiseypeeimentpeoeideatheoeeticaebasisfoetheteeatmentofdoyoeubicininducedcaediomyocyteiniuey.Keywordt:euteoein;teansceiptome;caediomyocytes;mitochondeiaeeeongationfactoe1*通信作者Tel:86-21-64385700;E-mail:scptcm@126-comVol.32史有阳等:木犀草素通过MIEF1抗H9c2心肌细胞损伤的机制研究821治疗和姑息治疗中重要的组成部分[1]。心脏毒性是阿霉素临床应用主要不良反应之一，随着剂量的增加，心脏毒性的发生率升高[2],因此寻找减轻阿霉素心脏毒性的有效药物具有重要意义。中药桔梗辛、苦、平,具有宣肺祛痰、利咽排脓的功效。神农本草经有云:“主胸胁痛如刀刺,腹满肠鸣幽幽，惊恐悸气课题组前期研究发现，桔梗能够提咼阿霉素化疗后乳腺癌病人的左心室射血分数，减轻阿霉素带来的心脏毒副反应⑷。桔梗与阿霉素联合应用可提升乳腺癌肺转移小鼠左心室射血分数水平，增强心脏泵血功能，促进阿霉素在肺部的聚集,降低其在心脏的分布*5+&但具体药物活性成分及作用机制并不明确。木犀草素（luteoOn,Lui）是一种分布广泛的类黄酮，常以糖昔类形式大量存在于包括桔梗在内的多种中药中⑷&现代药理学研究表明，Lut具有抗肿瘤[7]、抗氧化*8+、心血管保护的功能⑼，但对心肌细胞保护的具体机制并不明确&本研究拟用阿霉素建立心肌细胞损伤模型，通过转录组学测序筛选出Lui作用靶点，并运用分子生物学技术,对潜在靶点线粒体延长因子1（1X0-chondRalelongationfactor1,MIEF1）进行抑制，探究Lut对人心肌细胞损伤的保护作用及机制，为进一步治疗阿霉素化疗后心脏毒性提供依据&1材料1-1细胞野生型大鼠H9c2心肌细胞购自中国科学院上海细胞库&低表达MIEF1大鼠H9c2心肌细胞由本实验室构建&1-2药物及试剂木犀草素（成都曼思特生物科技有限公司，批号:MUSTP7102605，纯度&98%）;MTT粉剂（美国Sigma公司）;阿霉素（碧云天生物技术有限公司,批号:SC0159）;RPMI-1640培养基（美国Hyc/nv公司）;磷酸盐缓冲液（PBS）、胎牛血清#FBS）、青链霉素双抗、胰蛋白酶（美国Gibica公司）;Qub/h-0DNA检测试剂盒（LiftQ10212）;MIEF1抗体（北京博奥森生物技术有限公司，批号:bs-12634R）;p-Dr1（SeR37）,Caspasv-C抗体（美国CellSignaling公司，批号分别为4867,9662）;TRzol,GAPDH,HRP标记的山羊抗兔IgG二抗（上海生工生物有限公司,批号B511311、D110016、D110058）;siRNA转染试剂盒（苏州吉玛生物有限公司，批号004003）。1-3仪器细胞培养箱（美国TheRia公司）;QubiR.0荧Q32866Ineitoogen;RTPPCR（Theomo司）;电泳仪及酶标仪（美国BII-RAD公司）;倒置显微镜（日本Olympus公司）;HReqTM测序仪（美国Humins2方法2.1细胞培养）&大鼠H9c2心肌细胞接种于含10%胎牛血清,1%青链霉素混合液的1640完全培养基，于37g,5%CO2培养箱中培养，每3天以0.25%胰酶消化传代&2.2增殖抑制率测定取5x103对数生长期H9c2细胞接种于96孑L板中，置于培养箱中继续培养&24h后，弃去培养基，每孔加入Dao（1!M）及不同浓度的Lut（5、10、20!M）作用24h&每孔加入15MTT反应4h,加入DMSO150^L,振荡5mR,用酶标仪测定波长为490nm处的光密度值（OD值），按下式计算:细胞增殖抑制率=（对照组0D值-实验组0D值）/对照组0D值x100%2.3总RNA提取与测序取对数生长期5x104个H9c2心肌细胞，种入6孔板&设置为正常组、Dao（1rM）组、Dao（1^M）加Lut（20rM）组，每组3个样本重复，药物处理24h后，加入氯仿，离心，异丙醇萃取后乙醇洗涤沉淀&干燥后，加入ddHO溶解RNA,琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性&以短片段RNA为模板，合成一链cDNA,加入缓冲液、dNTP、RNase和DNApo/merasaI合成二链cDNA;将双链cDNA修复、加A尾并连接测序接头,PCR扩增,按照1:1的比例等量混合后，采用Hiseq™1测序仪进行测序,TRRmomatic,HI-SAT2及StOngTia软件分析测序数据[10]&2.4差异表达基因靶点筛选采用DESeq进行显著差异的基因分析，用FoldChangv值表示基因表达的差异倍数，按I/g2（FolUChangy）I>1且3<0.05,q<0.05的原则筛选差异表达靶点基因（differenUallyexpressedgene,DEG）&2-5低表达MIEF1基因H9c2细胞的构建及验证为了进一步明确MIEF1与Lut改善心肌细胞损伤的关系，利用分子生物学技术构建SRNA-MIEF1抑制H9c2细胞中MIEF1的表达&取对数生长期野生型大鼠H9c2心肌细胞，以5x104每孔种于6孑L板内，待细胞贴壁后分为5组,正常组加入常规培养822天然产物研究与开发Voe.32,及对数生长期野生型大鼠H9c2心基，其余4组分别加入空载体siRNA、siRNA-MIEF11号、2号、3号Mata转染试剂复合物，晃培37g,CO?培养箱染24h,养基均匀后Westernblot验证MIEF1蛋白的抑制效果。2-6RTXCR法验证细胞MIEF1mRNA表达情况，以5“2.5”项，x104每于6提取总RNA。MIEF1及GAPDH基因引物由苏州吉玛生物有限公司设计。MIEF1基因上游引物F5XGGGAGGAACCAAACUGGAUTTOX下游弓I物R5AUCCAGUUUGGUUCCUCCCTTOXGAPDH基因上游弓I物F5XGGTGCTGAGTATGTCGTGGAGOX下游弓|物R5'ATGCTGACAATCTTGAGGGAGO'。两步法进行2.7蛋水平法（Westernblot）检测蛋白表达，45循。取对数生长期H9c2心肌细胞，以每孔5x104个接种于6孔板，每孔2mL，设置为正常组，低表达MIEF1加Dco#1pM）组，Dco#1pM）组，低表达MIEF1加Dex#1pM）加Lut#20pM）组。收集细胞，冰上裂解30min后，15000离心15min,，电泳、后，5%，抗上，BCA法测定BSA2h。一抗说明书按1:1000体加入液中到所，4C抗说明书1:2000，加入二抗室。2h后ECL化学发光显色剂显色，用凝胶分析系统扫描出图像。2-8方法用SPSS21.0进行统计学分析，实验数据以较采用单因素较用t检验，P<0.05为差均数土标准差#x±s）表示，方差，两统计学意义。3结果3.1Lut对Dex诱导后H9c2细胞活力的影响较,Doo组H9c2与正力降低#P<0.05）;与Dco组比较，不用浓度Lut处理后,-H9c2显著差异（P<0.05）。20pMLut效果最好，因此后续选择20pM进行转录力明显提升，的存活率较Dco（见表1）。表1Lut对Dox诱导后H9c2细胞活力的影响（X士s,n=4）Table1EffectofLutonH9c2cellsactivitytreatedwithDox#x±s,n=4）组别Group浓度存活率Concentration#pM)Sumivalrate#%)正常NomnalDoxDo@+Lut-11+51+10100.0060.00±3.69*64.46±6-16#83.60±2.90#1+20注:与正常组比较，*P<0.05;与霉Note:Comparedwithnormal,*P<0.05;ComparedwithDox,#P<0.05.3.2细胞差异基因表达情况87.77±6.09#，#P<0.05。将H9c2行准化，两录获得的基因表达量进P<0.05行较，且q<0.05,FoldChanya大于2倍及小于0.5倍的差异基因。如图1和表2所示，Dex组与正.行比较得到3582差基因，其中上调基因647s(wdl)sq•?-92dl)*6o一LSLOS007tog2(TPM)4-10-5051015log/TPM)5图1细胞差异基因散点图Fig.1ScatterplotofddferenOallyexpressedgenesincells注:A:Dox组os正常组;B:Dox+Lut组osDox组&Note:A:Doxgrouposnormalgroup;B:Dox+LutgrouposDoxgroup.Vot.32史有阳等:木犀草素通过MIEF1抗H9c2心肌细胞损伤的机制研究823品对方式SamplecomparisonmodeDoxvsControtDox+LutosDox表2细胞差异表达基因Table2Differentiallyexpressedgenesincells差表基因数Toto-numberofdiReRntil/expressedgents上基因数Toto-numberofup-regulatedgents358219816471811基因数Toto-numberofdown-regulatedgents2935170个，下调基因2935个%Lut加Dox组与Dox组进行较得到1981个差基因，其中上调基因1811,基因170&为了找到与用药相关的差异基因，选取Dox组对比正常组中上调且Dox加Lut对比Doxt的123基因;Dox组对比正常组中下调且Dox加Lu组对比Dox组上调的814基因（图2）对以上的交集基因进行&分析后发现，与正相比,Do组MIEF1基因著下调%而经过Lu治疗后，与Dox组相比,MIEF1基因表达水平得到恢复。因此,后期实验选择MIEF1作为LutgH9c2心的靶点基因。A524123;47图2细胞交集基因韦恩图Fig.2Venndiayramofintersectiongene3-3低表达MIEF1的H9c2细胞的验证MIEFloiRNA转染H9c2细胞24h后，Westernblot检测细胞MIEF1蛋白表达水平。MIEF1siRNA转染后，与野生型及体siRNA细胞相比，siRNA-MIEF11号细胞MIEF1蛋白的表达水平降低最为明显,转染效率最高（3<0.05）&RT-PCR实验证明，与正常组细胞相比，siRNA-MIEFl1号转染后的细胞MIEF1mRNA水平明显降低（3<0.05）&说明低表达MIEF1的H9c2细胞构建成功（见表3、表4、图3）&表3转染后细胞中MIEF1蛋白表达（P±s,n=3）Table3ExpressionofMIEF1proteintcrtransfection(p±s,n=3)组别Group正常NoRlctsiRNA-controtSRNA-MIEF1#1siRNA-MIEF1#2SRNA-MIEF1#3表Proteinexpression1.33±0.011.29±0.040.69±0.03*0.93±0.05*0.98±0.05*注:与正Nott:ComparedwiththtnoRictgroup,*P<0.05.较，*P<0.05&GAPDH36KDa表4转染后细胞中MIEFlmRNA表达（P±s%n=3）ABCDE图3转染后细胞中MIEF1蛋白表达电泳Fig.3ElectrophoresisofMIEF1proteinexpressionItertransfection注:A:正常组;B:siRNA-空白;C:-RNA-MIEF1#1%D:siRNA-MIEF1#2;E:siRNA-MIEF1#3&Nott:A:Normotgroup%B:siRNA-controt%C:siRNA-MIEF1#1%D:siRNA-MIEF1#2%E:siRNA-MIEF1#3-Table4ExpressionofMIEF1mRNAincellsaftertransfection(p:±<，n=3)组别Gup正常NormotsiRNA-MIEF1#1mRNA表mRNAexpression1.08±0.080.51±0.02*注:与正Noto:ComparedwiththenoRnctgroup,*P<0.05-较，*P<0.05&824天然产物研究与开发Vol.323-4Lut对H9c2细胞MIEFI、p-Nrpl(SeR37)、CaspaseO蛋白影响与Day组相比,siRNA+Day组MIEFI、p-Nrpl(SeR37)蛋白水平降低(P<0.05),CaspaseO蛋白的表达水平增加(P<0.05)&Lut+siRNA+Day组与siRNA+Day组相比，MIEFI、p-Nrpl(SeR37)蛋白水平上升(P<0.05),CaspaseO蛋的表达水平(P<0.05)(见表5和图4)&4阿霉素(doxorubicin,Dox)又称多柔比星，属蔥环类抗生素，用于恶性肿瘤的，但因其出现剂赖性心脏，限了用。蔥'52KDa82KDa35KDa36KDa图4细胞中MCFI、p-DrI(SeR37)、CaspaseO蛋白表达电泳Fig.4ElectrophoresisofMCFI,p-DyI(SeR37)，CaspaseOproteinexpressionincells注:A:正常组;B:siRNA+Dox组;C:Dox组;D:Lut+siRNA+Dox组&Note:A:Normalgroup;B:siRNA+Doxgroup;C:Doxgroup;D:Lut+siRNA+Doxgroup.表5Lut对H9c2细胞MCFI、p-DrpI(SeR37)、CaspaseO蛋白影响(x±s,n=3)Table5EffectofLuteolinonMCFI,p-DyI(SeR37)，CaspaseOproteinexpressioninH9c2cells(x±e，n=3)组别Group正常NormalsiRNA+DoxDoxp-Dyl(SeR37)表达量p-Dyl(SeR37)expression1.02±0.010.59±0.03*0.93±0.010.75±0.03#CaspaseO表达量CaspaseOexpression0.85±0.081.36±0-10*0.71±0.081.05±0.03#浓度Concentration()jlM)mcfi表达量MCFIexpression-Ii0.89±0.070.44±0.00*0.81±0.080.56±0.01#Lut+siRNA+Dox20+1注:与Dox组比较，*P<0.05;与siRNA+Dox组比,#P<0.05&Note:ComparedwiththeDoxgroup,*P<0.05;ComparedwiththesiRNA+Doxgroup,#P<0.05-药物致心脏损伤的确切机制目前尚不清楚EQ,因此霉素心脏的分子,研发有效的抗阿霉素心脏的药物尤为重要。目前，的学者发现，中药复方及所成效保护蔥药物对心脏的线粒体是的“能量工厂”，在所*13，14]&中心肌细是含线粒体最多的细胞。线体形功能对于正常的心脏生理功关重要*15]&研究表明,，其通断地融变化的线粒体是一合与以稳态。当心线粒体融合，程形及功，进而导致心脏功害*16]&研究报道，在凋亡期，线粒体出现了断裂以及e重构,线体融合、控也与了凋亡过程。，Tang等*17]研究发现，阿霉素可心线粒体过度分裂从而导致细胞发生凋亡。MCFI,又称MiD5I，是一与调控线粒体融合分裂的重要分子，位于线粒体外膜上*18],作用是通过招募下游动力相关蛋白I(Drpl)到线粒体上，使得Drpl在SeR37点发生磷酸化*19]，从而抑线粒体过度分裂，减少细胞凋亡*20]&研究报道，在利用CRISPR/cas9技术敲除MCFI的293T细胞中，线粒体，线体功到破坏*21]&此可见,MCFI在调控线粒体融合分裂方面发挥了举足重的作用&本研究发现，Lut作用阿霉素诱导的心肌细胞后，力到。转录学结果提示，阿霉素作用细胞后,MCFI表达水平明显下调,而经过Lut干预后,MIEFI水平又得到了恢复提升，因此确定MCFI可能是木犀草素发挥抗心脏毒性作用的在点&利用子生物学技术MIEF1及mRNA水平，通过Westernb/t检测下游p-Drpl(SeR37)及细胞凋亡经典通路蛋白CaspaseO水平后发现,1!M阿霉素作用心比，未CaspaseO及的变化。而Lut能够提高低表达MCFI细胞线粒体MCFI蛋白的表达，DrI蛋白在SeR37点的磷酸化，进而线粒体的，抑线粒体CaspaseO凋，与正相亡信号通路的&以上实验了木犀草素心肌保护的作用，但在线体Voe.32史有阳等:木犀草素通过MIEF1抗H9c2心肌细胞损伤的机制研究825的过程中是否有其他信号途径参与，有待进一步研agyanddoyoeubicinAinducedcaediotoyicity*p].LifeSci,究。参考文献1RivankarS.Anoverviewofdoxorubicinformulationsincano-ertherapy[J].JCancerResTher,2014,10（4）:853-858.2SilvaEF,BazoniRF,RamosEB,etal.DNA-doxorubicininteraction:newinsightsandpecu/aV/es*J].Biopolymers,2016,107（3）:e22998.3LiuLL,LiuS.DiscussiononapplicationofPlatycoboomotinboastcancer*J].ChinJTradeChinMedPharm（中华中医药杂志）,2010,25:2115-5117.4HaoW,LinS,QinY,etal.Cardioprotectivee/ectofPlatyc-odongrandioioruminpatientswitheaeeybeeastcanceeeeceieAingantheacyceineAbasedchemotheeapy:studypeotocoefoearandomizedcontrolledtrial*J+.Trials,2017,18:386.5ShenM,ShiYY,WangGF,etal.PharmacokineticsofPlatye-odonisRadiycombinedwith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