北京地区元宝枫枯萎病病原菌的分子鉴定
【摘要】 为了明确北京地区元宝枫枯萎病的病原系。菌种类，以河北香河苗圃中典型的病株为样本，用组1.2方法织分离法获得真菌菌株ATW1-2，并对所得菌株进行形态学鉴定、rDNA-ITS序列分析。形态学观察结果表明，ATW1-2在PSA培养基上不产生气生菌丝，能产生紫色素，大型分生孢子镰刀形或椭圆形，无色，多胞;小型分生孢子卵形至椭圆形，无色，单胞或双胞。BLAST比对结果表明，ATW1-2的rDNA-ITS序列与GenBank序列数据库中已登陆的1.2.1PSA培养基的制备PSA培养基配制的具体成份及pH值如下[3]:马铃薯200.0g，蔗糖15.0g，琼脂8.0g，蒸馏水1000mL，pH6.2。1.2.2病原菌的分离培养采集发病元宝枫的根，从病健交界处切取长16个尖孢镰刀菌（Fusariumoxysporum）不同菌株序约2~3mm的一段，用75%的酒精浸泡5~6s，再在列的一致性均达到100%。因此，将北京地区元宝枫5%的次氯酸钠溶液中处理3~5min，然后在灭菌水枯萎病的病原菌鉴定为F.oxysporum。中漂洗3次，将其移置在马铃薯蔗糖琼脂培养基荩关键词:元宝枫;枯萎病;分子鉴定;尖孢镰刀菌（PSA）上培养，挑取所出现的菌落移置在斜面PSA元宝枫（AcertruncatumBunge）是槭树科（Aceraceae）槭属（Acer）落叶乔木，别名元宝树、平基槭、五脚树、华北五角枫等，因其翅果形状像中国古代金锭“元宝”而得名，其树姿优美，叶形秀丽，是重要的秋季观红叶树种[1-2]。最近几年，北京地区大量元宝枫出现了枯萎现象，发病初期个别枝条出现失水萎蔫、干枯现象，最终导致整株枯死，枯死叶片经冬不落。该病害在国内外还未见报道，本研究从河北香河苗圃中采集了元宝枫病害样本，通过组织分离、形态学观察，并结合rDNA-ITS序列分析对病原菌进行鉴定，旨在明确北京地区元宝枫枯萎病的病原菌种类，为制定有效的防治措施提供决策依据。1材料与方法1.1材料1.1.1供试病害样本培养基上，然后在显微镜下进行单孢分离，在小麦粒培养基上生长20d后，保存于40%（v/v）灭菌甘油中，置于-80℃的冰箱中备用，使用前在PSA平板上进行活化培养。1.2.3病原菌的形态鉴定将单孢分离物在标准培养基上培养，得到其纯培养物，观察其在PSA培养基上的培养性状、质地、色泽等。在OLYMPUSBX63显微镜下观察检测，测量大、小两型分生孢子的形态、大小、分隔数和产孢结构，以及厚垣孢子的有无、形态和着生方式。1.2.4病原菌的分子鉴定将分离菌株转接到铺有灭菌玻璃纸的新PSA平板上继续培养成纯的菌落，刮取菌丝，采用真菌基因组DNA快速抽提试剂盒（生工生物工程（上海）股份有限公司（B518229））提取其基因组DNA。采用rDNA-ITS通用引物ITS1（5′TCCGTAGGTG-作者简介:周江鸿/1972年生/男/博士/高级工程师，从事园2014年5月于河北香河大运嘉美园林工程有林树木土传病害防治研究。54CMYK北京园林/第35卷，总第129期/2019（3）AACCTGCGG-3′）和ITS4（5′GCATATCAATAAG-CGGAGGA-3′）[4]，在Bio-RadC1000Touch梯度基垂，逐步变干，枯死后不脱落。随病情发展扩展到树冠半边或整株，从上至下枝干逐渐枯死。随着因扩增仪上进行rDNA-ITS序列的PCR扩增，反地上部枝、干的枯死，地下的根皮层也逐渐变褐腐应在25μL体系中进行:模板DNA1μL、5U/μLTaq烂;将主干的韧皮部剥开，可见木质部部分维管束酶0.2μL、10×PCR反应缓冲液2.5μL、2.5mmol/L明显变为褐色，褪色区域在纵向扩展的同时又横dNTPs混合液2.0μL、10μmol/L的引物ITS1和引向扩展，因此在整个树干上呈螺旋式向上扩展（图物ITS4各1μL，无菌双蒸水补足至25μL。PCR反1）。应程序:94℃预变性5min;94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸105s，30个循环;最后72℃延伸10min，扩增产物在4℃条件下保存。取5μL扩增产物，与1μL上样缓冲液混匀，加入1%琼脂糖凝胶孔中，以DNAMarker为对照，在1×TAE电泳缓冲液中电泳，用凝胶成像系统检测PCR扩增产物大小;再利用T-载体PCR产物克隆试剂盒（生工生物工程（上海）股份有限公司（B522213））将得到的PCR产物连接至T载体，然后进行热激转化，挑取阳性克隆，送生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序，获得菌株的rDNA-ITS序列;在www.ncbi.nlm.nlh.gov数据库中进行BLAST比对，下载相似性较高的相关序列。利用MEGA7.0.26软件中ClustalX的进行序列比对和校准，以Neighbor-joiningTree方法构建进化树。2结果与分析图1元宝枫枯萎病的症状（a:枝杈枯死症状;b:枯萎茎干纵切）2.2病原菌的形态鉴定经过分离纯化获得菌株ATW1-2，在PSA培养基上，25℃培养5d，菌落直径达43mm，中央气生菌丝为白色、毡状，底层棕红色;菌落边缘粘滑、有2.1元宝枫枯萎病的症状观察隆起的纵向条纹，淡紫色，无气生菌丝（图2a）。菌元宝枫枯萎病是一种系统性侵染病害，植株丝透明，有分隔，表面光滑，宽1.2~3μm;小型分生的根、茎、叶、枝都可发病。幼苗染病，叶片萎蔫，孢子数量少，椭圆形，单细胞，大小:7~10μm×1.8~根茎基部变软坏死，上面产生白色霉层，最后全株2.5μm;大型分生孢子数量多，美丽型，月芽形，稍枯死。2年生以上大苗染病先从1~2个枝条上表现弯，多数3隔，大小:20~30μm×2.0~3.0μm;厚垣孢症状，逐步扩展到其它枝，病枝上叶片失水萎焉下子和有性阶段未见（图2b）。上述特征与王拱辰等图2菌株ATW1-2在PSA培养基上的菌落及分生孢子形态（a:菌落形态;b:分生孢子形态）55CMYK北京园林/第35卷，总第129期/2019（3）1996年[5]所描述的镰刀菌属（Fusarium）真菌的形态特征一致，因此初步确定其分类地位为:半知菌亚门（Deuteromycotina）/丝孢纲（Hyphomycetes）/瘤座菌目（Tuberculariales）/镰孢菌属（Fusarium）。2.3病原菌的分子鉴定以菌株ATW1-2基因组总DNA为模板，利用真菌通用引物ITS1和ITS4进行PCR扩增，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，长度为500bp左右（图3）。PCR产物连接至T载体，然后进行热激转化大肠杆菌，挑取阳性克隆进行序列测定，其长度为544bp，基因序列已提交至GeneBank，登录号为MN013922，具体碱基序列见表1。在www.ncbi.nlm.nlh.gov数据库中进行BLAST比对。由比对结果可知，ATW1-2的5.8SrDNA+ITS序列与Genebank已登录16个Fusariumoxysporum的rDNA-ITS序列都具有100%一致性，从而确定ATW1-2与F.oxysporum是同一个种。利用MEGA7.0.26软件中的Neighbor-joiningTree作进化树分析，结果表明ATW1-2与尖孢镰刀菌（F.oxysporum）（EU839398.1和EU839370.1）具有较近的亲缘关系（图4）。3结论与讨论图3菌株ATW1-2基因组DNA的PCR扩增结果（M:分子量;1~5为ATW1-2不同培养物的DNA扩增产物）组织，造成植物萎蔫死亡，引起植物的枯萎病，是生产上最难防治的重要病害之一。例如，由尖孢镰刀菌引起的合欢枯萎病给北京地区的合欢造成了毁灭性的损失，目前仍缺乏有效的防治措施[6]。镰刀菌枯萎病一旦发病很难控制，因此元宝枫枯萎病的防治应以预防为主。在城市绿化中调运元宝枫树苗，一定要加强植物检疫，先从源头控制好进苗关。在成片种植的区域一旦发现病株，要立即清除，同时对枯枝、病株集中销毁，并用20%石灰水对土壤进行消毒处理，防止病原菌传播蔓尖孢镰刀菌（F.oxysporum）是一种世界性分布延;同时对发病植株周围的树木用96%恶霉灵的土传病原真菌，它不仅可以在土壤中越冬越夏，还可侵染多种植物，包括粮食作物、经济作物、药用植物及观赏植物等，寄主植物达100余种，受害最重的有茄科、葫芦科和豆科植物等[5]，还未见槭3000倍液，50%多菌灵500倍液，或70%甲基托布津800倍液灌根，每年2~3次，三种药可交替使用[7]。元宝枫原产于我国华中、华东、西北、华北、东北南部等地，在原产地多生于海拔300~2000m的树科植物被尖孢镰刀菌侵染的报道。尖孢镰刀菌疏林、低山丘陵和平地，喜光，耐半阴;喜温凉湿润从根系侵染寄主植物维管束系统，然后沿导管向气候，耐寒性强，可耐-25℃的低温，较抗风，但过于地上部扩展，并且能够产生毒素，破坏植物的输导干冷或炎热则不利于其生长;对土壤要求不严，在表1菌株ATW1-2的5.8SrDNA+ITS序列（544bp）5′10203040503′TCCTCCGCTTATTGATATGCTTAAGTTCAGCGGGTATTCCTACCTGATCCGAGGTCAACATTC-AGAAGTTGGGGTTTAACGGCGTGGCCGCGACGATTACCAGTAACGAGGGTTTTACTACTACG-CTATGGAAGCTCGACGTGACCGCCAATCAATTTGGGGAACGCGAATTAACGCGAGTCCCAAC-ACCAAGCTGTGCTTGAGGGTTGAAATGACGCTCGAACAGGCATGCCCGCCAGAATACTGGC-GGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCG-CATTTTGCTGCGTTCTTCATCGATGCCAGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTGATTTA-TTTATGGTTTTACTCAGAAGTTACATATAGAAACAGAGTTTAGGGGTCCTCTGGCGGGCCGTC-CCGTTTTACCGGGAGCGGGCTGATCCGCCGAGGCAACAAGTGGTATGTTCACAGGGGTTTG-GGAGTTGTAAACTCGGTAATGATCCCTCCGCAGGTTCACCTACGGA56CMYK北京园林/第35卷，总第129期/2019（3）图4Neighbor-joiningTree方法构建的进化树酸性土、中性土及石灰性土中均能生长，在含盐量及育苗技术[J].现代农村科技，2012，（14）:163，165.0.2%以下土壤中能正常生长;抗旱但不耐涝，土壤[3]方中达.植病研究方法[M].北京:中国农业出太湿易烂根[1]，因此平原地区种植元宝枫时应避免版社，1998，46.种植在土壤粘重、通透性差，或过于低洼潮湿、排[4]陈剑山，郑服丛.ITS序列分析在真菌分类鉴定水不畅的地方;不要栽植在冷季型草坪中，且尽量中的应用[J].安徽农业科学，2007，35（13）:3785-避免种植成纯林。3786，3792参考文献[1]冯继涛，段战歌，李宏伟，等.元宝枫特性及平原区栽培管理技术[J].中国园艺文摘，2017，5:101，119.[5]王拱辰，郑重，叶琪明，章初龙.常见镰刀菌鉴定指南[M].北京:中国农业技术出版社，1996:36-37.[6]郑小海.合欢枯萎病的发生与防治试验初报[J].河南林业科技，2014，34（2）:42-43.[7]张建林，李月，叶蔚.合欢枯萎病的病症与防治[2]刘世东，孙开理，刘迎彩，等.元宝枫的应用价值措施探讨[J].绿色科技，2012，1:97，103.57
