聚［2-（丙烯酰氧基）乙基］三甲基氯化铵-乙二醇二甲基 丙烯酸酯整体柱固相萃取结合高效液相色谱法 测定尿液中 3 种苯二氮卓艹类药物
【摘要】 以[2-（丙烯酰氧基）乙基]三甲基氯化铵（DAC）为单体，乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDMA）为交联剂在注射器艹类药物（BZDs），并采用高效液相色谱法（HPLC）分析。实验考察了整体柱聚合时间及固相萃取条件（淋洗溶液、洗脱溶剂中制备聚合物整体柱，用其固相萃取尿液中溴西泮（BRZ）、劳拉西泮（LRZ）和地西泮（DZP）3种苯二氮卓种类和体积）对BZDs萃取效率的影响。结果表明，仅聚合4h得到的整体柱对BZDs吸附效率为100%。取尿液样品4mL上样，用4mLH2O冲洗，1mL乙酸乙酯洗脱，采用高效液相色谱分析。在最优条件下，3种BZDs在4.0~1000ng/mL范围内线性关系良好（r=0.999），检出限（S/N=3）和定量限（S/N=10）分别为1.0~1.2ng/mL和3.3~4.0ng/mL;在10、25和50ng/mL加标水平下回收率为81.4%~102%，日内（n=3）和日间（n=3）相对标准偏差分别为1.2%~4.5%和2.5%~8.3%。该整体柱可对尿液中3种BZDs有效净化，且富集达12~15倍。方法构筑的聚合物整体柱制备简单，萃取高效，可成功用于尿液中3种BZDs的分析。关键词:高效液相色谱;固相萃取;聚合物整体柱;[2-（丙烯酰氧基）乙基]三甲基氯化铵;苯二氮卓艹类药物;尿液中图分类号:O658文献标识码:A文章编号:1000-8713（2019）12-1343-06Determinationofthreebenzodiazepinesinhumanurinebysolid-phaseextractionwithpoly[2-（acryloyloxy）ethyl]trimethylammoniumchloride-co-ethyleneglycoldimethacrylatemonolithiccolumncoupledwithhighperformanceliquidchromatographyDULi1，LINa1，LIUMeikun1，WANGHanyun1，ZHANGQianying2，WANGManman1*，WANGXuesheng1*（1.SchoolofPublicHealth，NorthChinaUniversityofScienceandTechnology，Tangshan063210，China;2.NorthChinaUniversityofScienceandTechnologyAffiliatedHospital，Tangshan063000，China）Abstract:Apolymermonolithiccolumnwaspreparedinasyringebyusing[2-（acryloyloxy）ethyl]trimethylammoniumchloride（DAC）asamonomerandethyleneglycoldimethacrylate（EDMA）asacrosslinker.Theobtainedmonolithwasdevelopedasasolid-phaseextractionsorbentandusedwithhighperformanceliquidchromatography（HPLC）fortheanalysisofthreebenzodiazepines（BZDs）includingbromazepam（BRZ），lorazepam（LRZ）anddiazepam（DZP）inurine.Theeffectsofreactiontimeandthesolid-phaseextractionconditions（washingsolution，elutionsolventandvolume）ontheextractionefficienciesofthethreeBZDswereinvestigated.Themonolithiccolumnwassuccessfullypreparedwithin4h，anditoffered100%*收稿日期:2019-08-03*通讯联系人.E-mail:mmwangheuu@126.com（王曼曼）;E-mail:xswang64@163.com（王学生）.基金项目:河北省自然科学基金项目（H2017209232）;河北省教育厅重点项目（ZD2018014）.Foundationitem:NaturalScienceFoundationofHebeiProvince（No.H2017209232）;ResearchFoundationofEducationBureauofHebeiProvince（No.ZD2018014）.·4431·色谱第37卷adsorptionefficiencyforthethreeBZDs.Theurinesample（4mL）wasloadedonthemonolith，washedwith4mLofH2O，andelutedwith1mLofethylacetate.Undertheoptimizedcondi-tions，thelinearrangeswere4.0-1000ng/mLforthethreeBZDs，withcorrelationcoefficients（r）of0.999.Thelimitsofdetection（S/N=3）andlimitsofquantification（S/N=10）ofthethreeBZDswereintherangeof1.0-1.2ng/mLand3.3-4.0ng/mL，respectively.Therecov-eriesatthreespikedlevels（10，25and50ng/mL）ofthethreeBZDsrangedfrom81.4%to102%，withintra-dayandinter-dayrelativestandarddeviations（n=3）of1.2%-4.5%and2.5%-8.3%.ThepolymermonolithiccolumnprovidedeffectivepurificationforthethreeBZDsinurineandtheenrichmentfactorwas12-15.Thispolymermonolithicadsorbenthastheadvanta-gesofeasypreparationandhighextractionefficiency.Itissuccessfullyappliedtothedetermi-nationofthethreeBZDsinurinesamples.Keywords:highperformanceliquidchromatography（HPLC）;solid-phaseextraction（SPE）;polymericmonolithiccolumn;[2-（acryloyloxy）ethyl]trimethylammoniumchloride（DAC）;benzodiazepines（BZDs）;urine苯二氮卓艹类药物（benzodiazepines，BZDs）是艹的药物[1，2]，因具有吸收快、代谢快和用药量少等特点而被广泛应用一类母核结构为1，4-苯并二氮卓于临床治疗失眠和精神障碍类疾病。然而，长期服用BZDs易产生依赖性和耐药性[3]。大多数BZDs代谢后可经尿液排出体外，因此常通过测定尿液中BZDs的浓度评价该类药物的摄入情况以指导临床治疗[4]。目前，常采用高效液相色谱法（HPLC）、液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）和气相色谱-串联质谱法（GC-MS/MS）等测定尿液中BZDs[5-8]。羟基卡马西平进行前处理，结合高效液相色谱分析，检出限为0.004μg/mL和0.01μg/mL，回收率为92.7%和94.2%。Yang等[15]采用聚（乙烯基苯硼酸-N，N-亚甲基双丙烯酰胺）整体柱结合高效液相色谱对尿液中4种单胺类神经递质进行富集，富集因子高于17，检出限为0.06~0.08μg/L，回收率为81.0%~105.5%。本研究以[2-（丙烯酰氧基）乙基]三甲基氯化铵（DAC）为单体，乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDMA）为交联剂在注射器模具中制备聚（DAC-co-EDMA）在仪器分析之前，由于尿液成分复杂且BZDs整体柱，结合HPLC，建立简单、高效的尿液样品中3含量低，需要采用液液萃取（LLE）、固相萃取（SPE）种BZDs的分析方法。等技术进行富集净化。SPE是利用固体吸附剂吸附液体样品中的目标化合物，然后选择性洗脱，而达到富集净化复杂基质中目标化合物的一种前处理技术[9]。吸附剂作为其核心，决定了分析方法的时间、成本和准确度。目前主要使用亲水-亲脂平衡柱、离子交换柱和C8/C18柱等商品化固相萃取柱[10，11]对尿液中BZDs进行前处理。基于吸附剂在分析过程中的重要作用，新型高效吸附剂的开发成为研究热点。1实验部分1.1仪器、试剂与材料Agilent1260型高效液相色谱-二极管阵列检测器（HPLC-DAD，美国Agilent公司）;HitachiS-4800扫描电子显微镜（日本日立公司）;FTIR-8400S傅里叶红外光谱仪（日本岛津公司）。80%（质量分数）DAC水溶液、乙酸乙酯（ethylacetate，色谱纯）和EDMA（纯度98%）（上海阿拉丁有机聚合物整体柱是通过单体、致孔剂、交联剂试剂公司）;甲醇（methanol，MeOH）和乙腈（ace-和引发剂等混合物的原位聚合得到的连续棒状材料，具有制备简单、性质稳定和结构多孔等特性[12]。与填充型吸附剂相比，它避免了装填过程，使用时其多孔结构易于传质，提高了萃取效率，因而被广泛用于样品前处理领域[13]。李娜等[14]使用聚（乙二醇二甲基丙烯酸酯）整体柱对血清中卡马西平和10-tonitrile，ACN）（色谱纯，美国ThermoFisherSci-entific公司）;醋酸铵（NH4Ac）、正丙醇、聚乙二醇400和偶氮二异丁腈（纯度99%，天津市光复精细化工研究所）;丙酮（acetone，唐山市路北区化工厂）;娃哈哈纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司）;ProElutC18固相萃取柱（60mg/3mL，北京迪马科技发展公第12期杜梨，等:聚[2-（丙烯酰氧基）乙基]三甲基氯化铵-乙二醇二甲基丙烯酸酯整体柱固相萃取结合高效液相色谱法测定尿液中3种苯二氮卓艹类药物·5431·司）;一次性聚乙烯无菌注射器（2mL，江西丰临医1.4固相萃取用器械有限公司）。标准品:溴西泮（bromazepam，BRZ，纯度使用MeOH和H2O各2mL，平衡聚（DAC-co-EDMA）整体柱，上样4mL尿液样品，加压使其以199.9%）、劳拉西泮（lorazepam，LRZ，纯度99.9%）和地西泮（diazepam，DZP，纯度99.9%）的甲醇标mL/min的流速流出，用4mLH2O冲洗，1mL乙酸乙酯洗脱，将收集的洗脱液于35℃、34kPa条件准溶液（1mg/mL）均购自美国Cerilliant公司，其下氮吹浓缩至干，使用MeOH复溶至0.2mL，过结构式见图1。图13种苯二氮卓艹类药物的化学结构式Fig.1Chemicalstructuresofthethreebenzodiazepines（BZDs）1.2聚（DAC-co-EDMA）整体柱的制备图2为聚（DAC-co-EDMA）整体柱的合成示意图。量取35μLDAC、500μLEDMA、1mL正丙醇、500μL聚乙二醇400和50μLH2O，混合均匀后，加入8mg偶氮二异丁腈，超声混合均匀。取500μL该溶液灌入一端封口的2mL注射器中，密封后于55℃水浴条件下反应4h。反应结束后使用MeOH冲洗，得到聚（DAC-co-EDMA）整体柱。滤，进行HPLC分析。1.5HPLC条件色谱柱:AgilentEclipsePlusC18柱（250mm×4.6mm，5μm）;柱温35℃;流动相为（A）H2O和（B）MeOH;流速为1mL/min。梯度洗脱程序为0~5.0min，62%B;5.0~13.0min，62%B~80%B。进样量:20μL;检测波长:228nm。2结果与讨论2.1聚（DAC-co-EDMA）整体柱的构筑和表征图3a为聚EDMA和聚（DAC-co-EDMA）整体柱的红外光谱图，与聚EDMA整体柱相比，聚（DAC-co-EDMA）整体柱在1456cm-1和950cm-1图2聚（DAC-co-EDMA）整体柱的合成示意图Fig.2Fabricationdiagramofpoly（DAC-co-EDMA）monolithDAC:[2-（acryloyloxy）ethyl]trimethylammoniumchlo-ride;EDMA:ethyleneglycoldimethacrylate.1.3尿液样品的采集和制备采集4例口服1mgLRZ患者9h[16]后的尿液样品，使用H2O稀释（尿液∶H2O=3∶1，v/v）后[8]，以1500r/min离心10min，收集上清液。采集若干名未服用BZDs的健康志愿者尿液作为对照样品，处理方法同上。本实验经华北理工大学医学伦理委员会批准。图3（a）聚EDMA整体柱、聚（DAC-co-EDMA）整体柱的红外光谱图和（b）聚（DAC-co-EDMA）整体柱的扫描电镜图（×5000）Fig.3（a）FT-IRspectraofpolyEDMAmonolith，poly（DAC-co-EDMA）monolithand（b）scanningelectronmicroscope（SEM）micrographofpoly（DAC-co-EDMA）monolith（×5000）·6431·色谱第37卷处出现的吸收峰为铵甲基C-H弯曲振动峰和季铵基团C-N伸缩振动峰，在1732cm-1和2881cm-1处出现的吸收峰为C=O伸缩振动峰和=C-H伸缩振动峰[17]，说明DAC与EDMA成功聚合。将聚（DAC-co-EDMA）整体柱进行扫描电镜表征，图3b2.2固相萃取条件的优化固相萃取的淋洗和洗脱步骤决定了该方法的准确度。实验固定上样体积为4mL，上样含量为50ng/mL，考察淋洗溶液和洗脱溶剂种类对3种BZDs回收率的影响。表明该柱具有均匀的孔结构，作为吸附剂使用时，有2.2.1淋洗溶液种类利于降低物质的传质阻力，并提高吸附效率。淋洗的目的是保留目标物的同时最大限度地去实验选择BZDs为探针目标物。固定反应温度除杂质，因此淋洗液的选择至关重要。以健康志愿者尿液样品分析，固定淋洗溶液体积为4mL，洗脱溶剂为1mL乙酸乙酯，考察了H2O、ACN-H2O（5∶95，v/v）、NH4Ac溶液（25mmol/L，pH=5）和0.9%（质量分数）NaCl水溶液的淋洗效果。以上4种淋洗液对杂质的去除率均达到90%以上，但当使用H2O作为淋洗液时，3种BZDs的回收率最高（见图5a）。因此实验选择H2O作为淋洗溶液。2.2.2洗脱溶剂的种类和体积洗脱条件决定了方法的准确度，实验固定淋洗溶液为4mLH2O，洗脱体积为1mL，考察4种洗脱为55℃，考察聚合时间为2、3、4和5h构筑的整体柱对3种BZDs吸附性能的影响（见图4）。随着聚合时间的延长，3种BZDs的吸附效率逐渐提高，当反应时间增加到4h时，吸附效率达100%，继续增加聚合时间至5h后，3种BZDs的吸附效率无明显变化，因此实验最终选择整体柱的聚合时间为4h。实验同时考察聚EDMA整体柱对3种BZDs的吸附效率，在相同吸附条件下，聚EDMA整体柱对BRZ、LRZ和DZP的吸附效率分别为39.0%、26.3%和92.8%，而聚（DAC-co-EDMA）整体柱对3种BZDs的吸附效率均达100%。聚EDMA柱床具有疏水性[18]，对脂水分配系数（logP）在2.2~4.0范围内的3种BZDs药物具有一定的吸附作用。当引入DAC单体后，整体柱柱床增加的铵基提供了离子交换基团，对于pKa在1.3~3.3范围内的3种BZDs而言，吸附作用显著提高至100%。以吸附效率的相对标准偏差（RSD）评价同一批次（n=3）和不同批次（n=3）制备的聚（DAC-co-EDMA）整体柱的重复性，批次内和批次间的RSD分别为1.7%~2.8%和3.0%~7.6%。该整体柱重复使用15次，以3种BZDs的吸附效率计算RSD，结果均≤8.9%。以上结果表明，该柱制备简单，用时短，吸附效率高且重复性良好。图4聚合时间对3种苯二氮卓艹类药物吸附效率的影响（n=3）Fig.4EffectofreactiontimeontheadsorptionefficienciesofthethreeBZDs（n=3）图5（a）淋洗溶液和（b）洗脱溶剂对3种BZDs回收率的影响（n=3）Fig.5Effectsof（a）washingsolutionsand（b）elutionsolventsontherecover-iesofthethreeBZDs（n=3）Solutions1-4wereH2O，acetonitrile-H2O（5∶95，v/v），ammoniumacetateaqueoussolution（25mmol/L，pH5）and0.9%（massfraction）sodiumchlorideaqueoussolution，respectively.第12期杜梨，等:聚[2-（丙烯酰氧基）乙基]三甲基氯化铵-乙二醇二甲基丙烯酸酯整体柱固相萃取结合高效液相色谱法测定尿液中3种苯二氮卓艹类药物·7431·溶剂（丙酮、ACN、MeOH和乙酸乙酯）对目标物的洗脱效果。当洗脱溶剂为乙酸乙酯时，3种BZDs的洗脱效果最佳，回收率为97.3%~105%（见图5b）;继续增加洗脱体积，会延长氮吹浓缩的时间。因此，实验最终选择1mL乙酸乙酯进行洗脱。2.3聚（DAC-co-EDMA）整体柱的富集净化效果为了评价聚（DAC-co-EDMA）整体柱对尿液中BZDs的富集净化效果，对BZDs标准溶液（750ng/mL）（见图6a）和加标50ng/mL尿液样品进行分析。如图6b所示，尿液样品直接进样分析时，杂质的信号超过2500mAU，3种BZDs的响应信号低，无法定量。当经过聚（DAC-co-EDMA）整体柱富集和净化后（见图6c），杂质的信号明显降低，各目标物均得到有效富集，富集倍数为12~15倍，回收率为86.9%~102%。将尿液样品经商品化C18固相萃取柱前处理（见图6d），3种BZDs的回收率为68.1%~114%，并且杂质响应信号明显高于聚（DAC-co-EDMA）整体柱的净化结果。说明聚（DAC-co-EDMA）整体柱净化效果更佳。2.4方法验证2.4.1线性范围、检出限和定量限在最佳实验条件下，在4.0~1000ng/mL范围内配制一系列3种BZDs的标准溶液（n=7）进行分析，以目标物的质量浓度（x，ng/mL）为横坐标，峰面积（y）为纵坐标，构建标准曲线（见表1）。结果表明，3种BZDs在4.0~1000ng/mL范围内线性关系良好，相关系数（r）为0.999。对健康志愿者的尿液样品分析，按信噪比（S/N）=3和S/N=10分别计算方法的检出限（LOD）和定量限（LOQ），结果分别为1.0~1.2ng/mL和3.3~4.0ng/mL。图6（a）BZDs标准溶液（750ng/mL）以及加标尿液样品（50ng/mL）（b）直接进样、（c）经本方法处理和（d）经C18固相萃取柱处理的色谱图Fig.6Chromatogramsof（a）BZDs（750ng/mL）inthestandardsolution，spikedurinesample（50ng/mL）with（b）directanalysis，（c）pretreatedbypoly（DAC-co-EDMA）monolith，and（d）pre-treatedbyC18SPEcolumn表13种BZDs的线性范围、回归方程、相关系数、检出限、定量限、回收率和精密度Table1Linearranges，regressionequations，correlationcoefficients（r），LODs，LOQs，recoveriesandprecisionsofthethreeBZDsAnalyteLinearrange/（ng/mL）RegressionequationrLOD/LOQ/（ng/mL）（ng/mL）Spiked/（ng/mL）Recovery/%（n=3）RSDs/%（n=3）Intra-dayInter-dayBRZ4.0-1000y=144.2x+28.870.9991.2LRZ4.0-1000y=137.6x+32.390.9991.2DZP4.0-1000y=149.9x+38.600.9991.0y:peakarea;x:massconcentration，ng/mL.4.04.03.310255010255010255087.581.486.993.494.810210093.288.41.42.31.24.53.02.21.41.82.37.42.56.16.02.56.48.36.38.1·8431·色谱第37卷2.4.2回收率和精密度为了验证该方法的准确度和精密度，以健康志愿者的尿液为样品，加标10、25和50ng/mL3个水平进行分析（n=3）。如表1所示，3种BZDs的回收率为81.4%~102%，日内和日间精密度（n=3）分别为1.2%~4.5%和2.5%~8.3%。表明该方法准确可靠。2.5实际样品分析为了进一步验证方法的可行性，使用聚（DAC-[3]YanAH，LiXL，XiCX，etal.ChineseJournalofAnalyti-calChemistry，2013，41（4）:509严爱花，李贤良，郗存显，等.分析化学，2013，41（4）:509[4]ZhangJL，WangZL，ZhangYN.ChineseJournalofAnaly-sisLaboratory，2014，33（3）:479张建丽，王占良，张亦农.分析试验室，2014，33（3）:479[5]ArnhardK，SchmidR，KoboldU，etal.AnalBioanalChem，2012，403:755[6]LiangC，YeHY，WangR，etal.JSepSci，2015，38:1680[7]Gonzalez-MarinoI，CastroV，MontesR，etal.JChromatogrA，2018，1569:91[8]AsgharinezhadAA，EbrahimzadehH，MirbabaeiF，etal.co-EDMA）整体柱，结合HPLC测定4例服用LRZAnalChimActa，2014，844:80患者的尿液样品。在4例患者的尿液样品中均检出了LRZ，含量为（72.1±1.6）~（85.2±3.2）ng/mL，[9]ZhangLQ，WuPG，JinQ，etal.JChromatogrB，2018，1702:305[10]RacamondeI，RodilR，QuintanaJB，etal.JChromatogr加标回收率（加标水平为50ng/mL）为78.2%~A，2014，1352:6998.3%，RSD≤5.0%。3结论[11]AsimakopoulosAG，KannanP，HigginsS.AnalBioanalChem，2017，409:6205[12]ZhangH，BaiLG，WeiZ，etal.Talanta，2016，149:62[13]HuGY，WangMM，NianQX，etal.ChineseJournalof本研究制备了聚（DAC-co-EDMA）整体柱，并Chromatography，2018，36（4）:375结合HPLC建立了检测尿液中3种BZDs的方法。方法线性范围宽，灵敏度和回收率高。该整体柱制胡桂羽，王曼曼，念琪循，等.色谱，2018，36（4）:375[14]LiN，ChenXL，ZhangL，etal.ChineseJournalofChro-matography，2017，36（11）:1105备简单，富集净化能力高效，为尿液中BZDs的临床李娜，陈雪蕾，张磊，等.色谱，2017，36（11）:1105检测提供了一种新方法。参考文献:[15]YangXT，HuYF，LiGK，etal.JChromatogrA，2014，1342:37[16]JiangZL，TanJY，YaoLJ，etal.ChineseJournalofChromatography，2001，19（4）:342[1]HuangWH，XiaX，HuMH.ChineseJournalofAnalysis姜兆林，谭家镒，姚丽娟，等.色谱，2001，19（4）:342Laboratory，2019，38（1）:43[17]TianXZ，RenEH，WangJH，etal.CarbohydPolym，黄伟华，夏祥，胡美华.分析试验室，2019，38（1）:432012，87（3）:1956[2]PersonaK，MadejK，KnihnickiP，etal.JPharmBiomed[18]LiH，AiLF，FanSF，etal.JChromatogrB，2017，1065:Anal，2015，113:23979
