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医学
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基于网络药理学的墨旱莲-女贞子药对“异病同治”糖尿病肾病与糖尿病视网膜病变的机制研究
目的]通过网络药理学的方法，研究墨旱莲-女贞子药对“异病同治”糖尿病肾病（DN）与糖尿病视网膜病变（DR）的药理作用机制，验证国医大师吕仁和教授治疗DN与DR的临床经验。[方法]利用TCMSP、TCMID和Uniprot数据库，搜集并获取墨旱莲、女贞子的化学成分及其作用靶点。利用NCBI-gene、Genecards和OMIM数据库搜集DN和DR的疾病相关靶点。通过String数据库、Cytoscape3.7.2软件、TBtools软件构建药物靶点蛋白相互作用网络，获取交集靶点。利用BioGPS数据库和Cytoscape3.7.2软件构建作用靶点-组织分布网络图，运用GO数据库和Cytoscape3.7.2软件的ClueGO插件对交集靶点进行GO和KEGG富集分析。[结果]墨旱莲-女贞子药对主要含有14个活性成分和124个潜在作用靶点，DN相关靶点2614个，DR相关靶点2587个，其中药对同时作用于DN和DR的共同靶点有63个。有11个作用靶点在胰岛、视网膜和肾脏高表达，KEGG富集分析得到共同靶点主要富集在糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、TNF信号通路和IL-17信号通路等115条通路上，涉及对含氧化合物的反应、细胞对化学刺激的反应、对脂质的反应和细胞群增殖的调节等1686个生物过程。[结论]墨旱莲-女贞子药对可能通过调节多个靶点、多条通路和多个生物反应过程，达到对DN与DR的“异病同治”作用，为吕仁和教授的临床经验用药提供了网络药理学验证，也为今后进一步研究墨旱莲-女贞子药对的药理作用机制提供了依据。关键词:墨旱莲;女贞子;糖尿病肾病;糖尿病视网膜病变;异病同治中图分类号:R587.2文献标志码:A文章编号:1673-9043（2021）03-0374-10开放科学（资源服务）标识码（OSID）:糖尿病是一种多因素导致的糖代谢异常疾病，为23%[3]，两者分别是末期肾病和成人致盲的主要2019年全球糖尿病患病率为9.3%，预计2030年将上升到10.2%[1]，糖尿病肾病（DN）与糖尿病视网膜病变（DR）是临床常见糖尿病微血管并发症，是血糖原因。DN是由糖脂代谢障碍、氧化应激失衡、炎症因子失调和血液微循环失调等原因导致的肾小球病异常导致的肾脏病变与眼底病变。对于糖尿病患者变[4]，DR是由高血糖、炎症反应、氧化应激反应和神来说，DN发病率能达到30%~40%[2]，DR患病率约*基金项目:国家自然科学基金面上项目（81873181，81473367）;国家自然科学基金青年基金项目（81603401）;中央级公益性经保护因子等因素引起的视力逐渐减退，最终导致失明[5]。理论上，DN与DR都属于糖尿病微血管并发症，两者可能有共同的发病机制，如高糖毒性、自由基作用、多元醇代谢异常、炎症介质氧化应激及科研院所基本科研业务费专项资金资助项目（Z0659，遗传因素等，并且有研究表明，眼底检查可提示糖[6]Z0647）;北京市科技计划课题资助项目（Z121100000312006）。作者简介:王娟（1997-），女，硕士研究生在读，主要研究方向为中西医结合基础。尿病患者的肾脏病变。传统中医理论认为，肝肾同[7]源，肾为肝之体，肝为肾之用，肾的疾病往往离不开通讯作者:顾浩，E-mail:hebegu@126.com;姜淼，E-mail:肝的失调，同时，肝开窍于目，五脏六腑之精皆上注miao_jm@vip.126.com。374于目，故肝与目在生理病理上密切相关，并且目的第40卷第3期2021年6月JournalofTianjinUniversityofTraditionalChineseMedicine天津中医药大学学报Vol.40No.3Jun.2021生理正常离不开肾精的调养，这就提示了DN与DR1资料和方法之间的密切联系，两者之间的发生与治疗可能存在1.1墨旱莲-女贞子药对化学成分的搜集与筛选通相通的地方。目前DN与DR主要采用药物治疗和过中药系统药理学数据库和分析平台（TCMSP，手术治疗，但是其存在药物抵抗和术后并发症等不http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）和中药化学成分数良反应。西医疗法联合中药治疗DN与DR在临床据库（TCMID，http://119.3.41.228:8000/tcmid/）搜索上很常见，但是大部分以单方剂为主，很少使用复关键词“墨旱莲”和“女贞子”，得到药物所含活性成方作为主要治疗药物，主要原因就是中药的有效成分相关信息，筛选符合条件的化合物作为药物有效分和药理作用机制尚不明确。成分，本研究筛选条件为口服生物利用度（OB）≥30%，国医大师吕仁和教授在临床治疗DN与DR脂水分配系数（Alogp）<5，氢键供体数（Hdon）<5，氢时，常配伍墨旱莲-女贞子对药，以滋补肝肾，明目凉血，治疗肝肾阴虚所导致的DN与DR等糖尿病并键受体数（Hacc）<10，肠上皮通透性（Caco-2）>0，类药性（DL）≥0.1，药物半衰期（HL）≥4[13]。发症，补阴以制阳亢。墨旱莲记载于《新修本草》，[8]1.2墨旱莲-女贞子药对靶点的筛选将筛选得到能够滋补肝肾，凉血止血;女贞子首载于《神农本草经》，主要功效是滋补肝肾，明目乌发，两药均具有抗的药对有效成分逐一输入TCMSP数据库，得到每个成分对应作用靶点，再利用蛋白质数据库（Uniprot，炎、抗氧化、免疫调节、治疗糖尿病等药理作用。[9-10]https://www.uniprot.org/）的UniProtKB功能，逐一录但是这一药对治疗DN、DR的具体作用机制尚不明确，因而限制了其在临床实践中的推广应用。入靶点并将物种限定为人，将所有靶点校正为官方名称（officialsymbol），即为墨旱莲-女贞子药对的作网络药理学是基于系统生物学和多向药理学用靶点。的角度，对药物治疗疾病的作用成分、作用靶点和作用通路进行解析，构建整体网络模型，从多角度深入探讨药物治疗疾病的药理作用机制，并且现在已经有许多研究证明了网络药理学方法对探索中1.3DN与DR的靶点筛选利用GeneCards数据库（http://www.genecards.org/）、NCBI-gene数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene）和人类孟德尔遗传数据库OMIM（http://www.omim.org/）3种数据库，输入药治疗疾病作用机制的可靠性和准确性。Guo等[11]关键词“DiabeticNephropathy”“DiabeticRetinopathy”利用网络药理学研究了左金丸治疗肝癌的作用机查找筛选疾病相关的靶点。制，并且验证了左金丸通过PI3K-NF-κB、EGFR-MAPK1.4靶点蛋白相互作用网络构建将药对作用靶和CCND1通路对肝癌细胞的抑制作用。马林等[12]通点输入String数据库（https://string-db.org/），置信度过构建成分-靶点-通路网络模型，预测了丹七片治设置为0.9，得到药对靶点蛋白相互作用（PPI）网络疗冠心病可能是通过丝氨酶/基氨酸/蛋白激酶模型，将数据导出，输入Cytoscape3.7.2软件，进行（AKT1）、白细胞介素（IL）-6、肿瘤坏死因子（TNF）、可视化，并利用MCODECluster算法[14]，按照默认参丝裂原活化蛋白激酶（MAPK1）等关键靶点。利用网数（NodeScoreCutoff:0.2，Haircut:true，Fluff:false，络药理学从成分、靶点、通路、生物过程等方面整K-Core:2，Max.DepthfromSeed:100）对网络进行模体分析探索墨旱莲-女贞子药对“异病同治”DN与DR块划分。的作用机制，符合中医理论的整体作用特点，也为中药复方制剂的机制研究提供一种新思路新方法。1.5作用靶点与组织分布网络构建将共同靶点输入BioGPS（http://biogps.org/#goto=welcome）数据传统中医理论认为“异病同治”指不同的疾病库，以大于等于中位数的基因表达量为界限筛选出在发生发展过程中出现了相同病机，故而可以采用每个靶点基因分布的器官/组织，整理胰岛同样的方法加以治疗，墨旱莲-女贞子药对滋补肝（PancreaticIslet）、视网膜（Retina）和肾脏（Kidney）肾以治疗DN与DR符合“异病同治”的理念。本文中的表达基因，利用Cytoscape3.7.2软件构建作用利用网络药理学的方法，探索墨旱莲-女贞子药对靶点-组织分布网络图。的有效成分、关键作用靶点和通路，以明确其作用1.6基因功能和通路富集分析通过TBtools软件机制，为中药复方治疗DN与DR的药理作用研究（https://github.com/CJ-Chen/TBtools）获取墨旱莲-提供参考，以期进一步推进中医药治疗糖尿病慢性并发症的临床应用。女贞子药对、DN、DR的共同靶点，将共同靶点输入基因功能资源数据库（THEGENEONTOLOGY375第40卷第3期2021年6月JournalofTianjinUniversityofTraditionalChineseMedicine天津中医药大学学报Vol.40No.3Jun.2021RESOURCE，GO，http://geneontology.org/）进行基因靶点，包括TP53、AKT1、TNF、RELA、VEGFA、MAPK1/功能富集分析，将分析得到的相关性前12个结果8/14等都与DN和DR的治疗直接相关，很有可能是通过柱状图展示。墨旱莲-女贞子药对“异病同治”DN与DR的关键将共同靶点输入Cytoscape3.7.2软件插件靶点。ClueGO[15]中，计算富集结果的每个P值，并通过2.3基于网络模块化分析墨旱莲-女贞子药对治疗Bonferroni方法校正，以P<0.05为筛选条件，根据从DN与DR的靶点利用MCODE网络模块划分方小到大的顺序对P值进行排序。法，对墨旱莲-女贞子的靶点网络降维分解以便更2结果清晰明了地观察和分析网络，最后得到8个核心模2.1墨旱莲和女贞子的有效作用成分在TCMSP块，结果见OSID。其中有7个模块与DN、DR都相数据库中，根据筛选条件筛选得到符合要求的活性关，模块6中没有与DN或者DR直接相关靶点。同成分，墨旱莲有10种，女贞子有5种，详细信息见时，结果显示墨旱莲-女贞子药对“异病同治”DN与表1。DR的靶点主要分布在模块1、2、3中，对这3个模2.2构建墨旱莲-女贞子药对治疗DN与DR的靶块中的药对、DN、DR的共同靶点进行KEGG通路点网络模型通过整理得到墨旱莲的作用靶点和生物过程（BP）富集分析，得到的结果见表2。88个，女贞子的作用靶点111个，去重后得到墨旱2.4基于靶点-组织分布分析墨旱莲-女贞子的DN与莲-女贞子药对的潜在作用靶点124个，DN相关靶DR作用机制利用BioGPS数据库和Cytoscape3.7.2点2614个，DR相关靶点2587个。其中墨旱莲-女软件构建墨旱莲-女贞子药对“异病同治”DN与贞子药对与DN直接相关的靶点88个，与DR直接相DR的作用靶点-组织分布网络图，见图1。图中共有关的靶点69个，韦恩分析图见开放科学（资源服务）66个节点，130条边，其中边的粗细代表了靶点在组标识码（OSID）。利用String数据库和Cytoscape3.7.2织中的表达量大小，从图中可以看出，APP、VEGFA、软件构建的墨旱莲-女贞子靶点相互作用关系网络GSTP1、INSR、VCAM、ACHE和SELE等11个作用见OSID，节点连接度排名前20位的靶点连接靶点靶点均在胰岛、视网膜和肾脏组织中高表达，其具数目见OSID，RXRA与DN、DR的治疗不直接相体信息见图2。关，CDK1、CDKN1A、RB1、CASP8只与DN的治疗直2.5墨旱莲-女贞子药对作用于DN、DR靶点的接相关，CCNA2与DR的治疗直接相关，其他14个GO分析对墨旱莲-女贞子药对作用于DN与DR中药编号化合物相对分子质量AlogPHdonHaccOB（%）Caco-2DLHL表1墨旱莲与女贞子的活性成分信息表墨旱莲墨旱莲墨旱莲墨旱莲墨旱莲墨旱莲墨旱莲墨旱莲1金合欢素[acacetin]2紫铆素[butin]284.28272.2731，3，8，9-四氢氧基苯并呋喃[1，3，8，9-300.23tetrahydroxybenzofurano[3，2-c]chromen-6-one]43'-O-甲基原糖[3'-O-Methylorobol]5红车轴草素[Pratensein]6去甲蟛蜞菊内酯[demethylwedelolactone]7蟛蜞菊内酯[wedelolactone]300.28299.27302.25314.268（Z）-1-（2，4-二羟基苯基）-3-（3，4-二羟基苯基）272.27[prop-2-en-1-one（Z）-1-（2，4-dihydroxyphenyl）-3-（3，4-dihydroxyphenyl）prop-2-en-1-one]墨旱莲9（-）-氧化石竹烯[（-）-Caryophylleneoxide]墨旱莲、女贞子10木犀草素[luteolin]11山萘酚[kaempferol]12雌黄醇[eriodictyol]13透明碱[Lucidusculine]14DBP女贞子女贞子女贞子女贞子376220.39286.25286.25288.27401.60278.382.592.302.482.051.371.102.732.633.522.071.772.031.464.20234324340444205576677516665434.9769.9433.9457.4139.0672.1349.6083.7832.6736.1641.8871.7930.1164.540.670.300.010.450.390.040.320.101.580.190.260.170.160.800.240.210.430.270.280.430.480.170.130.250.240.240.750.1317.2516.809.6217.3117.139.179.6119.886.5115.9414.7415.8110.555.41第40卷第3期2021年6月JournalofTianjinUniversityofTraditionalChineseMedicine天津中医药大学学报Vol.40No.3Jun.2021表2核心模块中“异病同治”靶点的KEGG通路和BP富集分析编号KEGG通路P值生物学过程1Smallcelllungcancer8.50E-07responsetonutrientlevelsProstatecancerHepatitisBPathwaysincancerThyroidcancer8.50E-07responsetoUV1.54E-06responsetoantibiotic2.00E-06responsetosteroidhormone3.31E-06responsetodrug2Proteoglycansincancer1.04E-09reproductivestructuredevelopmentAGE-RAGEsignalingpathwayindiabeticcomplications5.22E-09regulationofcellpopulationproliferationToxoplasmosis5.83E-09mammaryglanddevelopmentKaposi`ssarcoma-associatedherpesvirusinfection5.49E-08positiveregulationofcellpopulationproliferationP值5.29E-055.29E-052.40E-042.50E-042.50E-049.46E-071.01E-051.87E-051.87E-05Pathwaysincancer6.48E-08positiveregulationofintracellularsignaltransduction2.17E-053Inflammatoryboweldisease（IBD）2.74E-07regulationofcellactivation3.21E-063.49E-06AllograftrejectionAfricantrypanosomiasis5.46E-06regulationofsignalingreceptoractivity5.46E-06positiveregulationofmulticellularorganismalprocess8.83E-06Jak-STATsignalingpathway5.46E-06regulationofcellpopulationproliferationIntestinalimmunenetworkforIgAproduction6.05E-06positiveregulationofleukocyteactivation8.83E-068.83E-06取交集，得到墨旱莲-女贞子既直接作用于DN又直接作用于DR的靶点有63个，对这63个靶点进行GO分析，发现1686个BP、68种细胞成分（CC）和136个分子功能（MF）可能与墨旱莲-女贞子药对“异病同治”DN与DR的机制相关。其中富集得到的前15个GO分析结果具体信息见图3。2.6墨旱莲-女贞子药对治疗DN与DR的KEGG通路分析通过ClueGo对墨旱莲-女贞子药对既直接作用于DN又直接作用于DR的63个靶点进行KEGG通路富集分析，得到115条通路（P>0.05），提取P值最小的前20条通路进行可视化分析，见图4，其中前10条通路详细信息见表3。3讨论3.1墨旱莲-女贞子药对治疗DN与DR的有效成分分析墨旱莲-女贞子药对治疗DN与DR包含木犀草素、金合欢素和山奈酚等14种有效成分，其中木犀草素是墨旱莲与女贞子的共同作用成分，而且关联了AKT1、INSR、MAPK1、TNF、VEGFA等关键靶点，表明木犀草素可能是墨旱莲-女贞子药对发挥协同作用的主要成分，研究发现，木犀草素能够通过降低TLR4与JNKmRNA的水平以改善2型糖尿病大鼠胰岛素的抵抗作用，可能通过增加超氧化物歧化酶（SOD）含量，激活Nrf2/HO-1通路而延缓糖尿病大鼠视网膜病变过程，而且能够明显减轻糖尿病引起的血管并发症。此外，墨旱莲的有效[16-18]成分金合欢素也能改善DN与DR患者的炎症反应377注:圆形节点代表作用靶点，三角形节点代表组织，边表示靶点在组织中的表达量大小，边越粗表明靶点在组织中的表达量越大。图1作用靶点-组织分布网络图图23个组织中同时高表达的作用靶点的相关信息柱状图第40卷第3期2021年6月JournalofTianjinUniversityofTraditionalChineseMedicine天津中医药大学学报Vol.40No.3Jun.2021）值Pg（l-注:横坐标代表GO分析结果名称，纵坐标表示-lg（P值）。图3墨旱莲-女贞子药对作用于DN、DR靶点的GO分析结果注:菱形节点代表通路，圆形节点代表靶点，圆形中有多个颜色则代表这个靶点存在于多条通路中。图4墨旱莲-女贞子药对治疗DN与DR的KEGG通路分析和细胞凋亡，女贞子的有效成分山奈酚能够通[19-20]VEGFA、GSTP1、INSR、TNF、AKT1、VCAM1、IL-6和过一定途径控制糖尿病患者的血糖水平。[21-23]MAPK1等靶点可能是墨旱莲-女贞子“异病同治”3.2基于KEGG富集与GO富集分析墨旱莲-女贞DN与DR的关键靶点，而且这些重要靶点大部分在子药对“异病同治”DN与DR的机制从药对的靶糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、TNF信点-组织分布网络和靶点蛋白PPI网络可以看出，号通路、IL-17信号通路、PI3K-Akt信号通路和378第40卷第3期2021年6月JournalofTianjinUniversityofTraditionalChineseMedicine天津中医药大学学报Vol.40No.3Jun.2021表3前10条KEGG通路信息通路PathwaysincancerP值2.04E-24AGE-RAGEsignalingpathwayindiabeticcomplications1.79E-21Fluidshearstressandatherosclerosis1.91E-18ToxoplasmosisKaposisarcoma-associatedherpesvirusinfectionTNFsignalingpathwayHepatitisBPancreaticcancerApoptosisIL-17signalingpathway9.78E-162.89E-134.77E-135.43E-131.50E-121.17E-112.71E-11基因数相关基因12201513152011111317AKT1，BCL2，EGFR，HMOX1，IFNG，IL6，INSR，MAPK1，NOS2，NOS3，RELA，VEGFAAKT1，BCL2，BCL2L1，CASP9，CCND1，CDK4，EGFR，FASLG，IL2，IL4，IL6，INSR，MAPK1，MCL1，MET，NOS3，PIK3CG，RELA，TP53，VEGFAAKT1，BAX，BCL2，BCL2L1，CASP3，CASP7，CASP9，FASLG，JUN，MAPK1，MAPK8，MCL1，RELA，TNF，TP53CASP3，IFNG，IL4，IL6，JUN，MAPK1，MAPK14，MAPK8，MMP1，MMP9，PTGS2，RELA，TNFAKT1，CASP3，CASP7，ICAM1，IL6，JUN，MAPK1，MAPK14，MAPK8，MMP9，PTGS2，RELA，SELE，TNF，VCAM1AKT1，BAX，BCL2，CASP3，CCND1，CDK4，ICAM1，IL6，JUN，MAPK1，MAPK14，MAPK8，MMP2，NOS3，RELA，SELE，STAT1，TNF，VCAM1，VEGFACASP3，CASP7，IL10，IL6，JUN，MAPK1，MAPK14，MAPK8，NOS2，RELA，TNFIFNG，IL10，IL4，JUN，MAPK1，MAPK14，NOS2，PTGS2，RELA，STAT1，TNFAKT1，FASLG，IFNG，IL10，IL2，IL6，JUN，MAPK1，MAPK14，MAPK8，NOS2，RELA，TNFAKT1，ALOX5，BCL2，BCL2L1，CASP3，CASP9，CD40LG，IFNG，IL10，MAPK1，MAPK14，MAPK8，NOS2，PIK3CG，RELA，STAT1，TNFHIF-1信号通路中都可富集到。糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路是DN与DR发生发展过程中的重要一环，能够激活核转录因子-κB（NF-κB），刺的反应、细胞对化学刺激的反应、对脂质的反应和细胞群增殖的调节等生物过程，进而对机体的氧化应激、炎症反应、糖脂代谢等过程进行调节，以影响激血管内皮生长因子（VEGF）、转化生长因子-β1DN与DR的病理进程。（TGF-β1）的产生，诱导单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）3.3墨旱莲-女贞子治疗DN与DR的核心模块分[24]表达，从而促使肾小球硬化、肾纤维化、炎症反应析与潜在作用靶点发现生物网络的聚类模块分发生、血栓形成和视网膜心血管生成。TNF-α是TNF信号通路中的核心基因，抑制NF-κB/TNF-α信号析是识别功能模块和预测蛋白质功能的重要方法之一，聚类结果的可视化对于揭示生物网络的结构通路的活化，可以减少促炎因子TNF-α、IL-1β的至关重要。在对模块分析结果中的3个核心模块进表达，进而对肾脏起到保护作用[25]，改善DN与DR行KEGG通路和生物过程富集分析发现，这些核心患者的炎症反应和视网膜内皮细胞凋亡。IL-17信模块中与DN、DR直接相关的靶点主要涉及肿瘤、号通路介导了炎症反应和相关的肾组织损伤与肾免疫和细胞因子传导相关通路，参与细胞应激反小球硬化[26]，抑制IL-17信号通路能够缓解DN、DR应、增殖和活化等生物过程，进一步验证了墨旱莲-的炎症反应和肾脏损伤。PI3K-Akt信号通路参与女贞子药对治疗DN与DR作用靶点对免疫系统和了高糖诱导的视网膜神经细胞凋亡过程，通过[27]细胞增殖与凋亡的影响。此外，GSK3β与MAPK8、PI3K-AKT/mTOR信号通路上调自噬，能够减轻氧JUN、AR在同一功能模块5中，而MAPK8、JUN、AR化低密度脂蛋白胆固醇（ox-LDL）诱导内皮细胞的与DN、DR的病理机制直接相关，这表明GSK3β与氧化应激损伤[28]。抑制HIF-1信号通路可以降低增DN、DR的病理作用是可能存在间接联系的，而且通殖性DR的病理性视网膜血管生成[29]，改善糖尿病过查阅文献发现，GSK3β是NF-κB介导的对TNF-α状态下肾脏肾小管上皮细胞间充质转分化及肾小的抗凋亡反应所必须的[31]，调控NF-κB信号通路和管间质纤维化[30]，从而改善DN、DR。TNF-α表达能够影响肾小球系膜的氧化应激反应墨旱莲-女贞子药对直接作用于DN和DR的和肾纤维化[32-33]，从而影响DN、DR的病理进程。XIAP63个共同靶点的GO分析结果表明，墨旱莲-女贞与CASP7、CASP9在同一功能模块7中，CYP1A1与子药对“异病同治”DN与DR的靶点主要集中在膜CYP1B1、AHR在同一功能模块9中，但是数据显示区、细胞质核周区域、膜封闭腔和胞质溶胶等细胞成分，同时影响酶结合、蛋白质结合、信号受体结合XIAP、CYP1A1与DN直接相关而不与DR直接相关。查阅文献发现，XIAP能够调节BMP信号通路以和BH3域结合等分子功能，并参与了对含氧化合物及SMAD和MAP3K7/TAK1依赖性通路[34]，从而导379第40卷第3期2021年6月JournalofTianjinUniversityofTraditionalChineseMedicine天津中医药大学学报Vol.40No.3Jun.2021致NF-κB和JNK活化，抑制JNK信号通路能够减少细胞凋亡，改善DR[35];CYP1A1参与NADPH依赖性电子转运途径，NADPH减少能够导致还原性谷探索墨旱莲-女贞子药对“异病同治”DN与DR的作用机制，意在从药物成分、靶点和通路层面研究中药药对的药理作用原理，但是中药在炮制及煎煮胱甘肽生成减少，从而降低细胞的抗氧化能力，加过程中可能会产生新的成分，而且机体的生理状态速细胞坏死[36]，这可能与DR的发生密切相关。这些与病理状态下的中药吸收、分布、代谢、排泄（ADME）研究表明，GSK3β、XIAP和CYP1A1可能是墨旱莲-女贞子药对“异病同治”DN与DR的潜在作用过程可能会有所不同，可能会影响药物的作用途径。而且，对于个体化的治疗数据以及数据的定量靶点，具有一定的研究价值，对后续新药研发和临化分析，对疾病的治疗具有重要意义，这就有待实床研究具有一定的启示作用。验研究和临床研究中相关数据的补充，为中药的网3.4利用网络药理学对“异病同治”理论的研究优络药理学研究提供更全面和科学的数据平台。势中医“异病同治”理论是对疾病的病机和症状4结论进行归纳总结并且在临床实践中得到了验证，但是由于现代临床状况和社会因素的影响，“异病同治”理论的病理发生机制和治疗机制均未得到充分的研究，这就限制了“异病同治”方法在临床中的应用，并且可能会错过某些疾病的良好治疗方法。网络综上所述，墨旱莲-女贞子药对“异病同治”DN与DR可能通过木犀草素、金合欢素和山奈酚等21种有效成分，作用于VEGFA、INSR、IL-6、AKT1、VACM1等关键靶点，进而调节糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、TNF信号通路和IL-17信号通路药理学是大数据时代利用计算机技术构建跨越药等，调节机体的氧化应激、炎症反应和糖脂代谢过物、分子、细胞、组织、器官、患者和疾病种类之间的整体网络，实现对靶标、通路、生物过程的筛选和临床研究前的预测和验证，能够节省大量的科研资源程等生物反应过程，以达到对DN和DR“异病同治”的治疗作用。同时，GSK3B、XIAP和CYP1A1可能是墨旱莲-女贞子药对“异病同治”DN与DR的潜在与经费，直接得到最关键的研究思路与研究方向。作用靶点，为临床新药的研发提供了一定思路。在本研究中，利用网络药理学对墨旱莲-女贞利用网络药理学的方法，对墨旱莲-女贞子药子药对对DN与DR的“异病同治”作用进行研究，对“异病同治”DN与DR的作用机制进行了研究，结探索了DN与DR两种疾病的共同靶点、共同通路和涉及的生物过程、分子功能及细胞成分，从多方果表明不论从作用靶点还是相关通路方面，墨旱莲-女贞子药对治疗DN和DR的作用机制都十分面验证了“异病同治”理论的科学性，如共同关键靶相似，这也从网络药理学的角度进一步印证了“异点VEGFA、AKT1、TNF和VCTM1等，这些靶点已经被证实在DN与DR的病理过程中起到重要作用:病同治”这一中医理论的科学性，验证了吕仁和教授的临床经验，为中药的临床应用与开发提供了一VEGFA水平下降可能导致HIF1A升高，进而导致DN定的研究方向。肾纤维化，使肾小球滤过率下降[37]，而且调节VEGFA能够抑制新血管生成和血管通透性增加进而缓解DR进程[29];降低TNF-α的表达水平，能够抑制DN患者的微炎症反应，改善肾功能[38]，调节TNF表达能够降低DR患者视网膜血管通透性增高和血管内皮细胞增殖。而且这些关键靶点在肾脏、视网膜和[39]胰岛中都有高表达，富集得到的相关通路也对DN、参考文献:[1]SAEEDIP，PETERSOHNI，SALPEAP，etal.Globalandregionaldiabetesprevalenceestimatesfor2019andprojectionsfor2030and2045:resultsfromtheinternationaldiabetesfederationdiabetesatlas，9thedition[J].DiabetesResearchandClinicalPractice，2019，157(11):107843.[2]KATOM，NATARAJANR.Epigeneticsandepigenomicsindiabetickidneydiseaseandmetabolicmemory[J].NatureDR的治疗意义重大。这些网络药理学分析结果都ReviewsNephrology，2019，15(6):327-345.从多方面验证了“异病同治”方法在临床应用中的[3]中华医学会糖尿病学分会视网膜病变学组.糖尿病视准确性和可靠性，两种不同的疾病在分子水平、细网膜病变防治专家共识[J].中华糖尿病杂志，2018，4(4):胞水平和组织器官水平的关联都得到了解析，由此241-247.可见“异病同治”理论的科学性以及这种方法广泛应用于临床的可行性。3.5前景与展望本研究利用网络药理学的方法380RetinopathyGroupofDiabetesBranchofChineseMedicalAssociation.Expertconsensusonpreventionandtreatmentofdiabeticretinopathy[J].ChineseJournalofDiabetes，2018，第40卷第3期2021年6月4(4):241-247.JournalofTianjinUniversityofTraditionalChineseMedicine天津中医药大学学报Vol.40No.3Jun.2021MAL，SHAOMY，SUNQB，etal.ThemechanismofDanqi[4]刘玉栋，孟祥云，程涛，等.糖尿病肾病中西医发病机制Tabletsinthetreatmentofcoronaryheartdiseasebasedon及治疗概述[J].西部中医药，2019，32(7):134-138.networkpharmacology[J].ActaPharmaceuticaSinica，2020，LIUYD，MENGXY，CHENGT，etal.Therapeuticoverview55(12):2942-2950.andthepathogenesisofdiabeticnephropathyfromintegra鄄[13]王永华，李燕.系统药理学[M].大连:大连理工出版社，tivemedicine[J].WesternJournalofTraditionalChinese2016.Medicine，2019，32(7):134-138.WANGYH，LIY.Systemspharmacology[M].Dalian:Dalian[5]陈丹丹，帅天姣，李娟，等.糖尿病视网膜病变微血管神InstituteofTechnologyPress，2016.经病变发病机制的研究进展[J].国际眼科杂志，2018，18[14]WANGJX，ZHONGJC，CHENG，etal.ClusterViz:a(5):844-846.CytoscapeAPPforclusteranalysisofbiologicalnetwork[J].CHENDD，SHUAITJ，LIJ，etal.ResearchprogressonACM，2015，12(4):852-855.thepathogenesisofmicrovascularneuropathyindiabetic[15]MLECNIKB，GALONJ，BINDEAG.Comprehensivefunc鄄retinopathy[J].InternationalEyeScience，2018，18(5):844-tionalanalysisoflargelistsofgenesandproteins[J].Journal846.ofproteomics，2018，171(11):2-10.[6]ASGHARZADEHM，GHORGHANLUS，RASHEDIJ，etal.[16]应巧，何斐，张伟，等.基于TLR4/JNK信号通路探讨木犀Associationofpromoterpolymorphismsofinterleukin鄄10草素对2型糖尿病大鼠胰岛素抵抗的改善作用[J].中国andinterferon鄄gammageneswithtuberculosisinazeri药师，2020，23(6):1064-1068.populationofiran[J].IranianJournalofAllergyAsthmaandYINGQ，HEF，ZHANGW，etal.ImprovementofluteolinImmunology，2016，15(3):167-173.oninsulinresistanceintype2diabeticratsbasedonTLR4/[7]GRUNWALDJE，ALEXANDERJ，MAGUIREM，etal.JNKsignalingpathway[J].ChinaPharmacist，2020，23(6):Prevalenceofocularfunduspathologyinpatientswith1064-1068.chronickidneydisease[J].ClinicalJournaloftheAmerican[17]邓向涛，郝海军，陈晓峰，等.木犀草素2种固体分散体SocietyofNephrology，2010，5(5):867-873.制备、表征和大鼠体内药动学行为研究[J].中草药，2018，[8]赵进喜，肖永华.吕仁和临床经验集[M].北京:人民军医49(24):5787-5793.出版社，2009.DENGXD，H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某军队中心医院骨科住院患者现况调查
目的对某军队中心医院骨科住院患者的一般情况和手术情况进行现况分析。方法回顾性分析某军队中心医院骨科2012-2017年住院患者信息，对患者一般情况进行描述性分析;对干部和战士手术患者比例、不同性别患者平均住院天数进行比较;统计住院原因和手术种类的分布情况。结果2012-2017年间，共收治现役官兵1462人次，平均年龄26.2岁，16~25岁患者数量最多，男性多于女性，平均住院天数16.2d。运动系统急性损伤患者806人次，前三位诊断为骨折、膝关节损伤(非骨折)、颈或腰部软组织损伤;运动系统慢性损伤282人次，前三位诊断为腰或颈间盘突出症、膝关节慢性滑膜炎、腰部软组织劳损。共施行手术659人次，四肢及躯干骨折内固定手术数量最多，其次为膝关节镜手术。结论应根据住院患者特点调整军队医院骨科医疗资源配置及专业发展方向。
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左室功能低下患者冠状动脉旁路移植术后心脏辅助装置应用情况及中远期疗效
目的评估左室功能低下患者行冠状动脉旁路移植术术后心脏辅助装置的应用情况及月，郑州大学第一附属医院心血管外科冠状动脉旁路移例，）岁。比较）]的临床数据。对所有患）、（]，围手术期死亡率更高（比）。左室功能低下组，此后趋于稳定。结论左室功能低下患者行冠状动脉旁路移植术心脏辅助装置应用率高，良好的围手术期管理可挽救部分患者生命，且中远期随访效果良好，在临床上值得推广。50±1211±4d%51±9]，差异均有统计学意义（均P<）1756ECMO33±1055±958.4±9.510.2%0.05）使用率更高，比），术后住院时间更长[（例）为对照组，男）及体外膜肺氧合（停留时间更长[（）6.3%0.7%LVEFICU15±3%ECMO4.7%比（个月（h%术后个月（，术后年（）比（）IABP（48±80.3%0.8%比h1d6）），术后3）
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人牙髓干细胞、牙周膜干细胞表型及生长特性分析
目的探讨人牙周膜干细胞与人牙髓干细胞的表型及生长特性。方法2018年7至12月选择18~25岁因正畸拔除完整第三磨牙10颗。取牙周膜干细胞、牙髓干细胞进行培养、纯化、扩增。统计细胞生长增殖OD，STRO-1、CD29、CD44、CD73、CD90、CD146、CD105、CD34、CD45表达率，集落生成率。结果牙髓干细胞培养3d出现快速生长，第9天后进入平台期;牙周膜干细胞在培养4d后开始快速生长，第8天进入平台期。2组在3~12d时，牙髓干细胞细胞增殖A值显著高于牙周膜干细胞，差异有统计学意义(P<0.05)。两种细胞STRO-1、CD29、CD44、CD73、CD90、CD146、CD105均呈高表达。2种细胞STRO-1、CD29、CD44、CD73、CD90、CD146、CD105、CD34、CD45表达率比较差异无统计学意义(P>0.05)。牙髓干细胞集落形成率显著高于牙周膜干细胞，差异有统计学意义(P<0.05)。结论人牙髓干细胞与人牙周膜干细胞
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揿针二白穴联合中药熏洗治疗痔疮术后疼痛临床观察
目的观察揿针二白穴联合中药熏洗治疗痔疮术后疼痛的疗效。方法选取痔疮术后出现疼痛的患者80例,随机分为对照组和治疗组,每组40例。对照组单纯采用西医常规换药及高锰酸钾坐浴方法治疗,治疗组采用揿针二白穴联合中药熏洗的方法,治疗7d为1个疗程,连续治疗2个疗程后分别观察两组的总有效率、疼痛评分、水肿评分、渗出物及创面愈合时间。结果两组治疗后疼痛评分均较治疗前降低(P<0.01),且治疗组治疗后疼痛评分低于对照组(P<0.05);治疗组水肿缓解、渗出物消失及创面愈合时间程度明显少于对照组(P<0.05);治疗组总有效率为95.0%,明显高于对照组的82.5%(P<0.05)。结论揿针二白穴联合中药熏洗可有效改善痔疮术后疼痛,症状改善明显,临床疗效较佳。
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microRNA与认知功能障碍相关的研究进展
microRNAs（miRNAs）是一类长度在22bp左右的非编码RNA，主要通过与靶基因特殊序列结合沉默其表达进而发挥作用。miRNAs在神经系统高表达并广泛参与神经发育、组织分化和神经突触形成等多种生命进程。大量研究表明，认知功能障碍疾病多与脑内认知相关的蛋白异常表达相关，溯源而上，参与蛋白表达的调控基因也同样参与了认知障碍的发生发展。那么，miRNAs与神经系统有何关系以及它是通过何种机制影响认知功能等问题将成为本综述阐述的重点，随着精准医学的发展，miRNAs有望成为认知功能障碍性疾病临床诊疗过程中新的靶点。
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产妇产后抑郁症相关因素与母亲角色适应、社会支持分析
目的探讨产妇产后抑郁症相关因素与母亲角色适应、社会支持情况。方法将423例产妇根据爱丁堡产后抑郁量表(EPDS)评分分为研究组82例(EPDS总分≥13)和对照组341例(EPDS总分<13)，两组均采用自设一般情况表、母亲角色适应调查表(MRAQ)、社会支持评定量表(SSRS)进行评定。结果423例产妇中，产后抑郁症的检出率为19.39%。研究组平均年龄低于对照组(P<0.05)，目前BMI指数高于对照组(P<0.05)。研究组MRAQ总分及SSRS各因子分均低于对照组(P<0.05)，且母亲角色适应状况比对照组差(P<0.05)。结论产妇产后抑郁症的状况较为严重，其与产妇的年龄、体型体质量变化程度、母亲角色适应、社会支持等状况存在相关。
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基于手机APP的社区戒毒电子系统有效性及适用性研究
目的探讨基于手机APP的社区戒毒电子系统在上海地区的有效性和适用性。方法在上海社区招募40名社区戒毒人员及其对应的社工，将其随机分为研究组和对照组各20名，探讨电子系统在提高社区戒毒人员的操守、改善社区戒毒人员的情绪状态及降低成瘾严重程度上的有效性。同时，对入组使用电子系统的社区戒毒人员和社工进行焦点小组访谈研究，通过半结构化的访谈和开放式提问，了解对在上海地区社区戒毒/康复中应用基于手机APP的电子系统的适用情况的观点和建议。结果研究组尿检曾记为阳性的人数少于对照组(P<0.05)，研究组PHQ-9、GAD-7得分均低于对照组(P<0.05)。社工和戒毒人员均对在上海地区现有社区戒毒康复工作中应用基于手机APP的电子系统持开放和谨慎乐观态度。在应用过程中需要注意提升使用依从性和使用友好性;对于完善系统的建议包括:在系统内引入和增加戒毒人员家属参与度、增加语音录入减少工作负担、增强信息互通等。结论基于手机APP的社区戒毒电子系统在上海地区具有一定的有效性和适用性。
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刘大新对七情理论的认识、思考与临床应用
七情是人体内脏腑精气对外在环境因素影响的一种应答，对于外界事物，人类表现出的态度和体会代表正常的心理状态，这种正常的心理状态受到不当的外界刺激时，出现过激或抑制的心理状态，就会影响人体的脏腑功能，导致人体阴阳气血的失衡而使人体患病，处于病理状态。中医学认为人体正常的情绪变化不会引起疾病，只有在强烈的刺激下情绪发生激烈的变化，才会对人体的健康造成影响，使人体生理活动处于不平衡的状态，造成疾病，即七情内伤。国家级名老中医刘大新教授精于医理，善于推究，文章就其对七情理论的认识、思考与临床应用进行了总结归纳。
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2012~2018年某部自备水源水质检测及不合格情况分析
目的统计分析驻京某部自备水源水质检测情况，分析不合格原因，为指导部队生活饮用水水源洁治处理和水质改善提供依据。方法按照《生活饮用水标准检验方法》(GB/T5750-2006)对驻京某部自备水源水质进行检验，依据《生活饮用水卫生标准》对水质状况进行评价，整理2012~2018年水质检测结果，将其录入Excel2003电子表格后进行统计分析。结果2012~2018年共检测水样1517份，合格1274份，总合格率为84.0%。243份不合格水样超标的项目共有16项，最多的一个水样有6项超标，总超标项次为361项次。超标率居前5位的项目依次为硝酸盐氮、总硬度、铁、细菌总数和色度，占总超标项目次数的60.11%。结论驻京某部自备水源有部分水质未达到国家《生活饮用水卫生标准》，超标项目比较集中且原因清楚，应采取针对性的整改措施，以确保生活饮用水的卫生安全。
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Beclin-1、P62、LC3B在肺炎链球菌感染小鼠肺部中的表达变化
目的:探讨自噬相关蛋白Beclin-1、P62及微管相关蛋白轻链3B（microtubule-associatedproteinlightchain3B，LC3B）在肺炎链球菌感染小鼠肺部中的表达及意义。方法:生长至对数生长期的肺炎链球菌标准株D39用无菌PBS调节浓度为1.5×109CFU/mL，采用鼻滴的方法对50只SPF级雌性Balb/c鼠（6~8周，16~20g）进行处理，分别在感染后0、6、12、24、48h收集Balb/c小鼠支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolarlavagefluid，BALF）及肺组织，瑞氏-吉姆萨染色进行BALF细胞计数，HE染色观察肺组织病理学改变，Westernblot检测自噬相关蛋白Beclin-1、P62、LC3B在肺组织中的表达水平，免疫荧光观察LC3B在肺组织中的表达情况。结果:HE染色显示，小鼠鼻饲肺炎链球菌后12h及24h后肺组织内出现大量炎症细胞浸润。BALF中总细胞数量及中性粒细胞数量于感染后6h开始增高[（1.280±0.506）vs.（6.272±1.312），P=0.000;（0.000±0.000）vs.（3.456±1.308），P=0.000]，在12h时达到高峰[（1.280±0.506）vs.（19.456±0.997），P=0.000;（0.000±0.000）vs.（15.040±1.012），P=0.000]，48h后基本恢复正常水平[（1.280±0.506）vs.（3.520±0.933），P=0.005;（0.000±0.000）vs.（0.128±0.175），P=0.835]。Westernblot结果显示:自噬相关蛋白Beclin-1于感染后6h开始增加[（0.626±0.078）vs.（0.921±0.093），P=0.002]，48h时达到最高水平[（0.626±0.078）vs.（1.884±0.158），P=0.000];自噬相关蛋白P62于感染后6h开始减少[（2.915±0.094）vs.（2.275±0.269），P=0.000]，48h时降低至最低水平[（2.915±0.094）vs.（1.178±0.142），P=0.000];自噬相关蛋白LC3B于感染后12h开始升高[（0.747±0.197）vs.（1.429±0.318），P=0.006]，24h时达到高峰[（0.747±0.197）vs.（2.002±0.451），P=0.000]，48h后降低[（0.747±0.197）vs.（1.563±0.501），P=0.002]。免疫荧光显示:小鼠感染后12h与24h，肺组织中LC3B蛋白表达水平增加。结论:肺炎链球菌感染小鼠肺部后激活自噬的发生，且自噬在免疫调节过程中发挥着重要作用。[关键词]自噬;肺炎链球菌肺炎;Beclin-1;P62;微管相关蛋白轻链3B[中图分类号]R563.1[文献标志码]A[收稿日期]2019-02-27ChangesintheexpressionofBeclin-1,P62，andLC3BinthelungsofmiceinfectedwithStreptococcuspneumoniaeChenXiaoli，XingYu，LiaoLichao，ZhangWenfang，ZhangZhibo，DengShixiong（LaboratoryofForensicMedicineandBiomedicalInformation，TeachingandResearchSectionofForensicMedicine，CollegeofBasicMedicine，ChongqingMedicalUniversity）[Abstract]Objective:Toinvestigatetheexpressionofautophagy-relatedproteins，Beclin-1，P62，andmicrotubule-associatedproteinlightchain3B（LC3B），inthelungsofmiceinfectedwithStreptococcuspneumoniae.Methods:AstandardstrainofStreptococcuspneumoniae（D39）inthelogarithmicgrowthphasewasadjustedtoaconcentrationof1.5×109CFU/mLbysterilizedphosphate-bufferedsaline;thentheresultingsolutionwasadministeredto50specificpathogen-freefemaleBalb/cmiceaged6-8weeksandwithaweightof16-20gbyintranasalinstillation.Thebronchoalveolarlavagefluid（BALF）andlungtissuesoftheBalb/cmicewerecol-lectedat0h，6h，12h，24h，and48hafterinfection.CellsintheBALFwerecountedafterWright-Giemsastaining;pathologicalchangesinthelungtissueswereevaluatedafterhematoxylin-eosin（HE）staining.WesternblotwasusedtodeterminetheexpressionlevelsofautophagyrelatedproteinsBeclin-1，P62，andLC3Binthelungtissues.ImmunofluorescenceassaywasemployedtoobservetheexpressionofLC3Binthelungtissues.Results:HEstainingshowedmassiveinflammatorycellinfiltrationinthelungtissuesofthemiceat12hand24hafterintranasalinstillationofStreptococcuspneumoniae.ThetotalcellcountandneutrophilcountintheBALFincreasedsignificantlyat6hafterinfection作者介绍:陈晓丽，Email:chenxiaoli1992@163.com，研究方向:法医病理学。通信作者:邓世雄，Email:dengshixiong1963@163.com。优先出版:http://kns.cnki.net/kcms/detail/50.1046.R.20190402.0900.004.html（2019-04-03）基础研究DOI:10.13406/j.cnki.cyxb.002046746--重庆医科大学学报2019年第44卷第6期（JournalofChongqingMedicalUniversity2019.Vol.44No.6）肺炎链球菌是社区获得性肺炎的常见致病菌，可适应人体环境并寄宿于健康人体的上呼吸道[1]。肺炎链球菌易侵袭婴幼儿、老年人及免疫功能缺陷者，引起细菌性肺炎、菌血症、脑膜炎等相关疾病[2]。肺炎链球菌所致疾病是儿童死亡的主要原因，在儿童死因中占11%，全球每年约80万小于5岁的儿童死于肺炎链球菌所致感染[3]。肺炎链球菌疾病是宿主与细菌相互作用的结果，最终导致细胞和组织损伤，甚至宿主死亡[4]。自噬是细胞利用溶酶体降解自身受损细胞器及蛋白质，并维持细胞内环境稳定的过程，被分为巨自噬、微自噬和分子伴侣介导的自噬[5]。自噬在应激反应、神经退行性疾病、癌症、衰老及炎症中发挥着一定的作用[6]。研究显示，肺炎链球菌感染细胞模型中存在细胞自噬现象，其具体机制尚不完全清楚[7]。本研究采用鼻饲D39肺炎链球菌建立小鼠肺炎链球菌肺部感染模型，探讨自噬相关蛋白Beclin-1、P62和微管相关蛋白轻链3B（microtubule-associatedproteinlightchain3B，LC3B）是否参与肺炎链球菌感染小鼠肺部过程，以进一步阐释肺炎链球菌肺炎过程中自噬的调控机制，为肺炎链球菌肺炎的防治提供可靠的实验依据。1材料与方法1.1菌株肺炎链球菌标准株D39由重庆医科大学医学检验、临床检验诊断学教育部重点实验室惠赠。肺炎链球菌标准株D39于TSB液体培养基37℃、5%CO2恒温环境中生长至对数生长期，3500r/min离心10min，无菌PBS洗涤2次，调节菌液浓度至1.5×109CFU/mL。1.2实验动物重庆医科大学动物中心健康成年清洁级雌性Balb/c小鼠50只（6~8周龄，18~20g），动物许可证号[SYXK（渝）2017-0023]。饲养环境为SPF级动物寄养室，饲养温度为（22±2）℃，相对湿度（55±10）%，12h光照，自由饮水进食。1.3主要的试剂Anti-LC3A/B（WesternBlot）、Anti-p62购自万类生物;Anti-Beclin-1购自SantaCruz公司;Anti-LC3B（免疫荧光）购自CellSignaling公司;Anti-β-actin购自北京中杉金桥生物技术有限公司。1.4实验动物分组及处理50只SPF级雌性Balb/c麻醉状态下鼻腔滴注浓度为1.5×109CFU/mL的肺炎链球菌D3920μL，于感染后0、6、12、24、48h5个时间点各随机抽取小鼠10只，麻醉状态下，用1mL无菌PBS液进行支气管肺泡灌洗（回抽率>80%），提取支气管肺泡灌洗液（BALF），每个时间点5只;另外5只取出左肺上叶-80℃冻存，右肺上叶及右肺下叶固定在4%甲醛溶液中。1.5肺组织病理检查右肺上叶于4%多聚甲醛溶液中固定48h，梯度乙醇脱水后常规石蜡包埋，切片，HE染色后光学微镜下观察。参照文献方法[8]对肺组织炎症浸润程度进行评分。1.6BALF细胞计数BALF用4℃离心机3500r/min离心10min，取沉淀，用500μL无菌PBS混匀，进行细胞涂片及瑞氏-吉姆萨染色，在光学显微镜下进行总细胞及中性粒细胞计数。1.7Westernblot免疫印迹法检测自噬相关蛋白Beclin-1、P62、LC3B的表达常规提取左肺上叶总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，以50μg总蛋白进行SDS-PAGE电泳，转膜0.5~1h，5%脱脂奶粉37℃恒温摇床封闭2h;一抗4℃孵育过夜;1%TBST洗膜3次，每次15min，二抗37℃恒温摇床孵育2h，1%TBST洗（6.272±1.312and3.456±1.308，respectively，bothP=0.000），reachedapeakat12h（19.456±0.997and15.040±1.012，respectively，bothP=0.000），anddecreasedtoanormallevelat48h（3.520±0.933and0.128±0.175，P=0.005and0.835，respectively），ascomparedwiththebaselinelevelsof1.280±0.506and0.000±0.000，respectively.Westernblotresultsshowedthattheautophagy-relatedproteinBeclin-1increasedfrom6hafterinfection（0.921±0.093，P=0.002）andreachedapeakat48h（1.884±0.158，P=0.000）comparedwiththebaselinelevelof0.626±0.078;theautophagy-relatedproteinP62decreasedfrom6hafterinfection（2.275±0.269，P=0.000）anddecreasedtoatroughlevelat48h（1.178±0.142，P=0.000）comparedwiththebaselinelevelof2.915±0.094;theautophagy-relatedproteinLC3Bincreasedfrom12hafterinfection（1.429±0.318，P=0.006），reachedapeakat24h（2.002±0.451，P=0.000），anddecreasedafter48h（1.563±0.501，P=0.002），ascomparedwiththebaselinelevelof0.747±0.197.ImmunofluorescenceassayshowedthattheexpressionofLC3Bproteinincreasedat12hand24hafterinfection.Conclusion:Afterinfectingthelungsofmice，Streptococcuspneumoniaeactivatesautophagy，whichplaysanimportantroleintheimmunemodulationinmice.[Keywords]autophagy;Streptococcuspneumoniae;Beclin-1;P62;microtubule-associatedprotein1lightchain3B747--重庆医科大学学报2019年第44卷第6期（JournalofChongqingMedicalUniversity2019.Vol.44No.6）膜3次，每次5min，ECL化学发光试剂盒显色。使用图像分析软件ImageQuantTL对光密度进行分析，最终结果以Beclin-1、P62、LC3B和内参β-actin的光密度比值表示。1.8免疫荧光法检测LC3B小鼠右下肺组织经4%多聚甲醛固定，10%、20%、30%蔗糖溶液梯度脱水，冰冻切片机切片。PBS溶液清洗3次，每次10min，荧光封闭液37℃恒温箱封闭30min;加入一抗工作液于4℃过夜，用PBS溶液代替一抗工作液设立阴性对照;37℃恒温箱复温1h，PBS溶液清洗3次，每次10min;加入二抗37℃恒温箱孵育1h，PBS溶液清洗3次，每次10min;DAPI染色5min，PBS清洗3次，每次10min。使用荧光显微镜观察LC3B荧光变化。1.9统计学处理采用SPSS17.0统计软件进行分析。所有数据以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组内两两比较采用LSD-t检验，检验水准α=0.05。2结果2.1肺组织病理检查鼻腔滴注1.5×109CFU/mL的肺炎链球菌D3920μL6h后，小鼠血管周围、支气管、细支气管周围出现炎症细胞浸润。随着时间的推移，炎症细胞浸润加重，肺泡间隔增厚，肺泡结构破坏，血管壁增厚（图1）。其肺组织炎症浸润程度评分如图2所示。2.2BALF中总细胞及中性粒细胞计数正常小鼠BALF中，主要以单核细胞为主。肺炎链球菌感染小鼠6h后，BALF中总细胞数量及中性粒细胞数量开始增高[（1.280±0.506）vs.（6.272±1.312），P=0.000;（0.000±0.000）vs.（3.456±1.308），P=0.000]，在12h时达到高峰[（1.280±0.506）vs.（19.456±0.997），P=0.000;（0.000±0.000）vs.（15.040±1.012），P=0.000]，48h后基本恢复正常水平图1小鼠鼻腔滴注浓度为1.5×109CFU/mLD3920μL后不同时间点肺组织病理切片注:，炎症细胞浸润0h6h12h24h48h200μm100μm50μm748--重庆医科大学学报2019年第44卷第6期（JournalofChongqingMedicalUniversity2019.Vol.44No.6）a:与0h组比较，P<0.05;b:与0h组比较，P<0.01;c:与0h比较，P<0.001图2小鼠鼻腔滴注浓度为1.5×109CFU/mLD3920μL后不同时间点肺组织病理评分（n=5）图3小鼠鼻腔滴注浓度为1.5×109CFU/mLD3920μL后不同时间点支气管肺泡灌洗液中总细胞及中性粒细胞计数情况（n=5）图4Westernblot检测不同时间点小鼠肺组织中Beclin-1、P62、LC3B蛋白的表达a:与0h组比较，P<0.05;b:与0h组比较，P<0.01;c:与0h比较，P<0.001图5小鼠鼻腔滴注浓度为1.5×109CFU/mLD3920μL后不同时间点小鼠肺组织中Beclin-1、P62、LC3B蛋白的表达（n=5）[（1.280±0.506）vs.（3.520±0.933），P=0.005;（0.000±0.000）vs.（0.128±0.175），P=0.835];如图3所示。2.4肺组织中Beclin-1、P62及LC3B蛋白表达水平的变化Westernblot结果显示:肺炎链球菌感染小鼠后，肺组织中Beclin-1蛋白逐渐增高，感染后48h仍处于较高水平[（0.626±0.078）vs.（1.884±0.158），P=0.000];肺组织中P62蛋白于感染后6h降低[（2.915±0.094）vs.（2.275±0.269），P=0.000]，感染后12h较感染后0h组明显降低[（2.915±0.094）vs.（1.564±0.228），P=0.000]，至48h仍处于较低水平[（2.915±0.094）vs.（1.178±0.142），P=0.000];肺组织中LC3B蛋白于感染后12h增高[（0.197±0.088）vs.（1.429±0.318），P=0.006]，至24h达到高峰[（0.747±0.197）vs.（2.002±0.451），P=0.000]，48h时较24h有所降低，但仍高于0h时水平[（0.747±0.197）vs.（1.563±0.501），P=0.002];如图4、图5所示。2.5免疫荧光法观察LC3B的表达LC3B在肺炎链球菌感染小鼠肺部后各个时间点均有表达，其中12h与24h较0h比较，LC3B的荧光信号明显增强，自噬细胞的数量增多[（3.333±1.528）%vs.（27.667±6.658）%，P=0.000;（3.333±1.528）%vs.（35.000±2.000）%，P=0.000）]。如图6、图7所示。3讨论肺炎链球菌是呼吸道内的常驻菌，在机体抵抗力下降时，特别是婴幼儿及年老体弱者，细菌更易侵袭致病，且预后大多不良[2]。肺炎链球菌是儿童呼吸道感染的常见致病菌，在全球小于5岁儿童中具有很高的致病率和致死率[3]。近年来因肺炎链球菌的耐药性逐渐增加、个体抵抗力低及诊治不及时等原因，最终引起的死亡成为目前医疗纠纷的案例之一。研究肺炎链球菌感染小鼠肺部模型，可为临床肺炎疾病的防治与法医学鉴定的病理诊断提供实验依据。肺炎链球菌可经呼吸进入下呼吸道，引起肺炎时间（h）61218243036424854bcca129630病理评分总细胞中性粒细胞时间（h）612182430364248540BALF中总细胞及中性粒细胞数量（104个/mL）0h6h12h24h48hBeclin-1P62LC3BLC3Aβ-actin60kD50kD47kD16kD14kD42kD时间（h）24481260Beclin-1的相对表达量2.52.01.51.00.50.0accc时间（h）24481260P62的相对表达量43210时间（h）24481260acbLC3B的相对表达量2.52.01.51.00.50.024201612840cccc749--重庆医科大学学报2019年第44卷第6期（JournalofChongqingMedicalUniversity2019.Vol.44No.6）a:与0h组比较，P<0.05;b:与0h组比较，P<0.01;c:与0h比较，P<0.001图7不同时间点自噬细胞百分比（n=3）注:，LC3B荧光信号增强图6免疫荧光观察不同时间点小鼠肺组织中LC3B蛋白的表达（400×）或中耳炎，也可经上皮细胞引起局部感染或菌血症[9]。本实验建立肺炎链球菌感染小鼠肺部模型，结果显示，肺组织及BALF中出现大量炎症细胞浸润，其中以中性粒细胞为主，提示小鼠肺部出现炎症反应，与Gomez等[10]肺炎链球菌感染小鼠肺部模型研究结果一致。当细菌入侵机体呼吸道，机体可通过不同途径清除入侵的病原菌，呼吸道上皮细胞与肺泡巨噬细胞分别可以通过纤毛运动、分泌黏液和吞噬作用清除部分病原菌，并在协同作用下合成趋化因子及其他细胞因子激活中性粒细胞，使中性粒细胞向感染部位聚集[9-12]。本实验发现，在感染后12h与24h，肺泡间隔增厚，肺泡结构破坏，血管壁明显增厚，支气管、细支气管管腔内大量炎症细胞聚集，其中以中性粒细胞为主，提示在此期间，肺部炎症浸润最明显，中性粒细胞在清除肺炎链球菌过程中发挥着重要作用。最近研究发现，真核细胞的自噬体具有清除病原微生物的功能，是上皮细胞、巨噬细胞、中性粒细胞清除病原微生物的机制之一，参与炎症的发生并在炎症反应过程中具有重要作用[13-15]。自噬是一种保守的细胞内降解途径，可通过双层膜将自身受损细胞器、蛋白质以及入侵病原菌包裹运输至溶酶体降解，维持细胞内环境稳定，包括自噬双层膜的形成、自噬体的形成、自噬体的运输与融合以及自噬体的降解4个阶段[16-17]。细胞吞噬细菌后，一方面，自噬时间（h）24481260accb403020100白噬细胞百分比（%）LC3BDAPIMerge0h6h12h24h48h20μm750--重庆医科大学学报2019年第44卷第6期（JournalofChongqingMedicalUniversity2019.Vol.44No.6）相关蛋白可促进包裹细菌的吞噬体与溶酶体结合，另一方面，自噬相关蛋白可捕获细胞内游离的细菌形成自噬体，并运输至溶酶体与溶酶体结合[18]。Beclin-1属于自噬相关蛋白家族，与Ⅲ类磷脂酰肌醇3激酶（ClassⅢPI3K）相结合构成自噬双层膜，并作为信号分子促进其他自噬相关蛋白的聚集，是参与调节自噬形成起始阶段的关键蛋白[19-21]。P62是自噬相关蛋白之一，在自噬形成过程中，P62作为底物不断被消耗，因而P62是反映自噬活性的关键蛋白[22]。LC3B是自噬特异性蛋白参与并调节自噬体的形成，是反映自噬活性的标志性蛋白[23]。本研究通过鼻腔滴注肺炎链球菌，建立肺炎链球菌感染小鼠肺部模型，结果显示，在感染后12、24及48h肺组织中自噬相关蛋白Beclin-1及LC3B的表达明显升高，P62的表达明显降低，与Li[13]和Ullah[24]等结果一致，提示肺炎链球菌可激活小鼠肺组织发生自噬，自噬活动在感染后12~48h期间最明显。相关研究表明，肺炎链球菌可通过抑制PI3K/AKT/mTOR通路从而激活A549细胞发生自噬，而通过药物抑制自噬后，细胞对细菌的清除减少，提示自噬活动能增强细胞对病原菌的清除[13]。综上所述，肺炎链球菌感染小鼠肺部后，可激活肺部发生自噬，而自噬的激活可能促进机体对细菌的清除，从而改善肺组织的损伤。而自噬在肺炎链球菌肺炎中具体的作用机制如何，需要进一步研究。参考文献[1]vanderPollT，OpalSM.Pathogenesis，treatment，andpreventionofpneumococcalpneumonia[J].Lancet，2009，374（9700）:1543-1556.[2]BogaertD，deGrootR，HermansPWM.Streptococcuspneumoniaecolonisation:thekeytopneumococcaldisease[J].LancetInfectDis，2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外泌体与Wnt3a联合诱导间充质干细胞归巢及定向分化
目的观察外泌体（exosome）联合Wnt3a蛋白刺激机体内源性干细胞归巢并定向分化后促进大鼠皮肤软组Wnt3a及组中及BMSCsVEGFBMSCsqRT-PCRqRT-PCRWesternblot方法观察外泌体联合蛋蛋Wnt3aWnt3a蛋白作用于间Wnt3a常规提取大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）来源外泌体，将外泌体联合织缺损修复的过程。方法充质干细胞，运用白在体外对白，采用免疫荧光染色、Westernblot归巢效应，并对创面愈合率进行分析，以观察该联合方案对组织创面的修复效果。结果照组方法检测血管形成相关细胞表面标志物的表达，明确外泌体联合的诱导分化作用。随后，制作大鼠大面积皮肤软组织缺损模型，组织创面注射外泌体和比较，Exosome+Wnt3a和刺激机体内源性干细胞后产生的干细胞检测结果显示，与对NG2、血管内皮细胞标表达均升高，证实产生分化。在大鼠大面积皮肤天愈合率达（93.05±2.72）%，明显高于其它组（P<组在术后第天的评分高于假手术组（P<0.01），而天出现了大量的新生血管，与假手术组比较差异有统计学意义[（48.260±1.821）个/mm2vs.（8.484±1.291）个/治疗后明显多于假手术组志物软组织缺损模型中，Exosome+Wnt3a160.01）。肉芽组织和伤口成熟度评分结果显示，Exosome+Wnt3a且第mm2，P<0.01]。免疫荧光染色结果显示，大鼠组织创面成熟血管数量在外泌体联合[（28.536±1.882）个/mm2vs.（4.712±1.883）个/mm2，P<0.01]。结论外泌体及分化，促进成熟肉芽组织沉积，加速创面血管形成，进一步促进组织创面修复，为临床上慢性创面的细胞治疗提供了新的思路。CD31、血管平滑肌细胞标志物表达明显下降（均的P<0.01），周细胞标记物组大鼠伤口创面在第蛋白可定向诱导qRT-PCRKlf4、Oct4α-SMAmRNABMSCsWnt3aWnt3aBMSCs119关键词:骨髓间充质干细胞;定向分化;中图分类号:R329.21DOI:10.3870/j.issn.1672-0741.2019.06.002外泌体;Wnt3a;归巢;创面再生HomingandDirectionalDifferentiationofMSCsInducedbyExosomeCombinedwithWnt3aYeTao，LiYongzhong，FuAihuaetalDepartmentofOsteology，TheSecondPeople`sHospitalofYichang（TheSecondPeople`sHospitaloftheChinaThreeGorgesUniversity），Yichang443000，ChinaAbstractObjectiveToexplorethespecificroleofWnt3acombinedwithexosomeinthehominganddirectionaldifferen-tiationofmesenchymalstemcellsandtheacceleratedcutaneoustissuereconstructioninrats.MethodsTheexosomederivedfromBMSCswascollectedandfurtherutilizedtoinducethedifferentiationofBMSCsinthecombinationwiththeWnt3a.Invitro，thespecificmarkersrelatedtotheangiogenesisintheBMSCswereevaluatedbyusingWesternblottingandqRT-PCR.Invivo，thefullcutaneousdefectsintheratswerecreatedandWnt3acombinedwithexosomewereinjectedaroundthewounds，andthentheacceleratedeffectofthiscombinatorytherapytowardsthewoundswasassessedbyusingtheimmunofluorescentstaining，WesternblottingandqRT-PCR.ResultsTheresultsofRT-PCRshowedtheincreasedexpressionofKlf4andOct4，NG2，VEGFandCD31，aswellastheα-SMAintheexosomecombinedwithWnt3agroupcomparedwithcontrolgroup，demon-stratingthedifferentiationofBMSCs.Invivo，theratstreatedwithexosomecombinedwithWnt3ashowedacceleratedrepairofthewoundsonday16[（93.05±2.72）%]comparedwithcontrolgroup（P<0.01）.TheresultsofthematurityscoreofthegranulationtissueandwoundsshowedtheenhancedwoundrepairintheexosomecombinedwithWnt3agroupcomparedwithcontrolgroup（P<0.01），furthermore，morenewformedbloodvesselswereobservedonday9comparedwithcontrolgroup[（48.260±1.821）/mm2vs.（8.484±1.291）/mm2，P<0.01].Inaddition，theimmunofluorescentstainingshowedthatthenumberofthematurebloodvesselsinthewoundsoftheratstreatedwithexosomecombinedwithWnt3awereincreasedcom-*国家自然科学基金青年科学基金资助项目（No.81402568）叶△通讯作者，Correspondingauthor，E-mail:lhwjqq@163.com年生，主治医师，E-mail:15897532022@163.com涛，男，1980万方数据·836·华中科技大学学报（医学版）2019年12月第卷第期648paredwiththecontrolgroup[（28.536±1.882）/mm2vs.（4.712±1.883）/mm2，P<0.01].ConclusionOurstudydemon-stratedthatexosomecombinedwithWnt3aisabletoinducethedirectdifferentiationofBMSCs，leadingtothedepositofmaturegranulationtissueandenhancedformationofbloodvesselstoacceleratethewoundrepair.Keywordsbonemarrowmesenchymalstemcells;exosome;Wnt3a;homing;differentiation;woundrepair随着人们生活水平提高，糖尿病、血管相关性疾病及相关代谢综合征的发生率逐年递增，由此引发的多种慢性难愈性创面也成为临床上的常见治疗难题[1-2]。而且，由于其临床疗效不能令人满意，至今仍是外科医生面临的一大挑战[3-4]。多聚甲醛固定，PBS原代细胞爬片免疫荧光染色50μL漂洗3%3封闭20min。加入约1.1.2BMSCs细胞爬片，4%作液孵育后加入制作次，破膜工过氧化氢溶液，室温避光孵育。稀释的各类一5%BSA抗[VEGF（1∶200）、CD31（1∶100）、NG2（1∶50）、α-SMA（1∶100）、Oct4（1∶100）、Klf4（1∶100）]覆孵育盖玻片，4℃50min。加5min。加入封片剂，在光镜下随机选取个视野，观察阳性细胞并拍照。二抗（1∶50），4℃染液，避光孵育过夜。加50μLDAPI6去除培养板中培养液，1.1.3qRT-PCR加1mLPBS溶液洗涤，采用BMSCscDNA合成，PCRUniversalRNAExtractionKit规流程进行s），紧接着为s，72℃20s），最后再以温72℃的速度进行熔解。以所用引物序列见表个循环扩增（分别为1℃40TaKaRaMiniBEST提取RNA。按照常扩增:预变性（95℃6095℃15s，58℃20持续升2-ΔΔCt法计算结果。qRT-InvitrogenBiotech-后以每5min20s1，引物由PCRnologyCo.LTD中国公司合成。表1PCR所用引物序列基因CD31α-SMAVEGFNG2Oct4Klf4Table1PrimersequencesforPCR引物序列退火温度（℃）正向:GATCTCCATCCTGTCGGGTAAC反向:GTGTCATTCACGGTTTCTTCGT正向:CAACCCCTATACAACCATCACAC反向:CCCAAACTGCTTGCGTAACC正向:ATCTTCAAGCCGTCCTGTGTG反向:AGGTTTGATCCGCATGATCTG正向:TTACCTTGGCCTTGTTGGTC反向:GATGATCTGTTTGGCCTGCT正向:GTGTTCAGCCAGACAACCATCT反向:GGTCTCCGATTTGCATATCTCCT正向:AGTCCCGAGGAACTGCTGAAC反向:GGCATGAGCTCTTGATAATGGAG正向:GCTGTGGTTGAGCCCTACAAT反向:GTAGGTTGGGCGCTCAATGT58585858585858RNA近年来，大量研究倾向于利用移植干细胞，通过旁分泌效应实现其定向修复再生的功能[5-6]。有文献报道，干细胞来源的外泌体（exosome）在受损组织修复方面扮演着重要角色，特别是外泌体内所包含的蛋白或成分已被证明能够参与靶向细胞的生物学行为[7-11]。但是，外泌体功能在特定条件下会受到抑制，例如肥胖会限制外泌体的促血管生成能力。临床上面对复杂的创面微环境时，如何最大程度发挥外泌体的作用引起了人们的重视[12-13]。目前单独应用外泌体修复皮肤创面仍存在较多问题，临床上需要引入联合应用方案以提高其修复与再生疗效。WntWntWnt3a蛋白作为信号通路的经典蛋白，富含半胱氨酸，广泛参与调节细胞生物学行为[14]。本课题组前期研究发现蛋白在骨髓间充质干细胞（bonemarrowmesenchymalstemcells，BMSCs）参与皮肤软组织缺损的修复过程中占有重要地蛋白在体内不稳定，因此，本研究将位[15-16]。Wnt蛋白作为治疗手段，观察该联合外泌体联合方案对诱导定向分化为皮肤血管化所需细胞的作用，以期进一步提升创面肉芽组织修复功能，促进伤口愈合。BMSCsWnt3a材料与方法1细胞实验方法1.1SDBMSCs和外泌体的提取、培养及BMSCs大鼠购自三峡大学实验动物中的提取、培养和鉴定按参考源性外泌体的大鼠骨髓1.1.1实验用鉴定心。大鼠原代文献[17]报道的方法进行。BMSCs提取按文献[18]报道的方法进行。常规培养组和SCs，分为对照组、Wnt3asome+Wnt3a组加入Wnt3a司），ExosomemL），Exosome+Wnt3a体，对照组不处理。置于隔次，共培养组，6Wnt3a（终浓度为组加入外泌体（终浓度为组、Exosome孔板培养，每组Wnt3a37℃、5%CO27~10d。40μg/蛋白和外泌培养箱中，每Exo-个复孔。公200μg/L，R&D万方数据组加入天换液331BM-α-tubulin动物实验方法1.2动物模型制作、分组及处理大1.2.1鼠购自三峡大学实验动物中心。嵌合体大鼠模型按个文献[19]描述进行CM-DiI线照射。骨髓移植:取与正常雄性大鼠不含实验用标记的BMSCs1000SDSDX的骨髓细胞按制成混悬液约BM-0.25mL，尾SCs1∶1000叶涛等.外泌体与Wnt3a联合诱导间充质干细胞归巢及定向分化·936·静脉注入前述嵌合体模型。移植后饲养个月。34122060mg/kg组，每组将造模成功的大鼠随机分为组，皮肤伤口周缘注射只，腹腔注射盐酸氯胺酮进行麻醉。以后正中线为纵径，行椭圆形全层皮肤切口，切除皮肤、皮下组织直至腰背筋膜。根据不同组别，在皮肤伤口周缘等分以后分点进行皮下注射。分组情况如假手术组，除全层皮肤切口以外，不做其余处下:①理;②Wnt3a溶液（PBS组，皮肤伤口周缘注射置，终浓度为皮肤伤口周缘先注射度为浓度为半透膜（VSD口。500μLWnt3a200μg/L）;③Exosome配组，配置，终浓配置，终组大鼠手术完毕后均以生物医疗技术公司，武汉）覆盖以封闭伤外泌体溶液（PBS100μg/L）;④Exosome+Wnt3a200μg/L），再注射外泌体溶液（PBS配置，终浓度为100μg/L）。4溶液（PBS500μLWnt3a病理学检测分别于术后第3、7、111.2.216日，观察各组动物伤口愈合情况。同时，取伤口处组织经伊红染色，用于观察伤（HE）染色、Masson`sTrichrome口肉芽组织形成及伤口组织成熟度[20]。包埋剂包埋，-80℃保存，行苏木精-OCT和1.2.3组织切片免疫荧光染色取大鼠伤口组织，5μm包埋，-20℃下于冰冻切片机中以CD31（罗丹明，红色）和连续OCT复染（蓝色），观切片，然后行免疫荧光染色，DAPI察α-SMA（FITC，绿色）表达情况，黄色代表成熟血管沉积。在光镜下随机选取软个视野，观察阳性细胞并拍照。最后以件将各通道照片置于同一视野下，并分析染色的色）共染（黄色）情况。CM-DiIBMSCs（红色）及各细胞相关分子标记（绿IPP61.3数±验，以SPSS23.0统计学方法运用标准差（-x±s）表示。组间均数比较采用P<0.05软件进行统计分析。结果以均检为差异具有统计学意义。t结果22.1大鼠所分离的细胞培养BMSCs体外分离及培养72h1A）。10d后在光镜下可见呈纺后细胞间隙变小，形态锤状或梭形（图类似于成纤维细胞，呈漩涡状生长（图1B），与课题组前期报道一致[15]。同时，免疫荧光结果显示，细表达呈阳性，提示该细胞具有干胞内细胞多能分化的特性（图应用于后期实验。1C），可作为BMSCsOct4Klf4及A:分离培养干细胞多能性相关标记物后，BMSCs72h贴壁生长情况;B:10d后，BMSCsOct4及Klf4，经过贴壁生长情况;C:免疫荧光染色证实所提取细胞的细胞核内高表达联合作用后表达下降及Oct4Klf4Exosome+Wnt3a图大鼠1BMSCs的形态学观察及鉴定Fig.1ThemorphologyoftheharvestedBMSCs的定向分化BMSCs和Klf42.2外泌体联合采用Wnt3a诱导检测qRT-PCROct4mRNA的表干表达明显下降Wnt3aBMSCs后细胞中Klf4、Oct42A）。采用达结果显示，与对照组相比，外泌体联合预[（0.427±0.018），（0.382±0.046），均（图血管内皮细胞标志物细胞标志物α-SMAmRNA联合干预后，各类细胞标志物（图白表达与P<0.01]NG2、和CD31、血管平滑肌水平表达情况，发现经表达明显增高2B）。免疫荧光染色的结果显示各类标志物蛋检测周细胞标志物表达变化趋势一致（图qRT-PCRmRNAVEGF2C）。万方数据mRNA2.3加快动物组织创面愈合外泌体联合将造模成功的大鼠随机分为Wnt3a41616和3、7、11组，分别于术后第日，观察各组动物伤口愈合情况，并进行评价。结果表明，第天，Exosome+Wnt3a组大鼠伤口创面愈合率可达（93.05±2.72）%，明显3A）。随后，采用肉芽高于其它各组（P<0.01）（图组织和伤口成熟度评分评估大鼠组织伤口修复情况，结果显示天的评分高于假手术组，差异具有统计学意义（P<伊红染色和0.01）（图组Masson3B）。同时，通过苏木精-染色，观察到第Exosome+Wnt3aExosome+Wnt3a组在术后第天1611·046·华中科技大学学报（医学版）2019年12月第卷第期648大鼠伤口创面有成熟肉芽组织沉积，表现为丰富的血管组织及周围的成熟胶原排列（图3C）。A:qRT-PCR检测BMSCsBMSCs检测在不同干预措施下，相关特异性标志物在不同干预措施下，其多能干细胞相关标记物NG2、VEGF、CD31Klf4和和观察Exosome+Wnt3a联合诱导后，BMSCs图中相关特异性标记物外泌体联合Wnt3a2Oct4mRNA表达情况，**P<0.01;B:qRT-PCR表达情况，**P<0.01;C:免疫荧光染色a-SMA蛋白表达情况a-SMAmRNANG2、VEGF、CD31诱导的定向分化BMSCs和Fig.2ThedifferentiationofBMSCsinducedbyexosomecombinedwithWnt3a组;②:Exosome组;A:伤口愈合曲线检测各组大鼠创面愈合情况，与假手术组比①:Sham伊红（HE）染色、Mas-较，**P<0.01;B:肉芽组织形成及创面成熟度评分评价各组大鼠创面成熟度情况，**P<0.01;C:苏木精-son组;④:Exosome+Wnt3a天各组大鼠创面修复情况组;③:Wnt3a染色观察术后第16万方数据Fig.3Woundhealingandrepairaftersurgeryindifferentgroups图3术后组织创面愈合和修复情况叶涛等.外泌体与Wnt3a联合诱导间充质干细胞归巢及定向分化·146·和CD31通过α-SMA免疫荧光双染共定位各组创面组织中血管生成情况，其中双染阳性标记为4A）。结果显示，Exosome+Wnt3a成熟血管[21]（图组大鼠第天出现了大量的新生血管，远多于假手术组[（48.260±1.821）个/mm2vs.（8.484±1.291）个/mm2，P<0.01，图天，Exosome+组大鼠组织创面成熟血管数量要明显多于Wnt3a假手术组[（28.536±1.882）个/mm2vs.（4.712±4B]。第1191.883）个/mm2，P<0.01，图4C]。16通过CM-DiI标记，我们观察到第天，Exo-组创面归巢的内源性干细胞数量远some+Wnt3a远大于假手术组[（2871.163±347.126）vs.（387.087±99.039），P<0.01，图5A、B]。同时，免组大部分疫荧光染色结果显示，Exosome+Wnt3a归巢的干细胞分化为血管化所需的周细胞及血管内皮细胞（图5C）。组;②:Exosome组;③:Wnt3a组;④:Exosome+Wnt3a组;A:CD31①:Sham血管，蓝色表示细胞核;B:各组大鼠创面新生血管计数，**P<0.01;C:各组大鼠创面成熟血管计数，**P<0.01α-SMA和共定位免疫荧光染色，其中黄色表示成熟图4术后创面血管再生情况Fig.4Regenerationofthebloodvesselsinthewoundsofdifferentgroups讨论3本文重点研究干细胞的旁分泌效应。通过联合WntWnt3a蛋白与通路信号分子应用经典BMSCs源性的外泌体，诱导干细胞分化为血管内皮细胞与平滑肌细胞，加速皮肤创面的血管新生，在细胞和动物水平验证了联合疗法的有效性，从分子水平证实了外泌体的联合应用策略能够诱导干细万方数据+Wnt3a胞的定向分化，提高外源性干细胞移植后的存活率，促进创面新生血管的形成和肉芽组织的成熟，最终实现修复大面积皮肤缺损的治疗目的。近年来，越来越多的学者倾向于移植干细胞通过旁分泌效应---外泌体来实现其组织修复再生功能[5-6，8，11，16，22-24]。有部分学者单独应用外泌体修复创面，结果显示外泌体能够促进表皮及真皮细胞再生[25-26]，但在复杂的创面及机体功能失调时外泌体·246·华中科技大学学报（医学版）2019年12月第卷第期648的作用并不稳定[12]，并且外泌体的体外获取量还无法满足目前临床上的需求。由此，本研究设计了联合应用外泌体蛋白的方案用于治疗大面积皮肤缺损以弥补上述缺陷，体内实验证实，联合疗法能够提高创面愈合率，增加创面肉芽组织的形成和成熟，最终显著促进创面愈合。+Wnt3a近年研究发现，当皮肤组织受到损伤时，机体可动员归巢到受损皮肤病灶，在损伤局部，它可分化为上皮细胞等皮肤效应细胞，进而促进缺损组织的修复和再生[24，27]。但归巢过程中干细胞的BMSCs动员差异较大，到达受损部位后的活性尚不能完成修复组织器官损伤的任务[28]。本实验所建立的荧光/普通大鼠嵌合体模型可以实时观察内源性SD的归巢、迁移及分化。实验结果也显示，机BMSCs体内源性间充质干细胞归巢至创面后在外泌体及蛋白的诱导下，于自分泌及旁分泌双重作用Wnt3a下完成定向分化（周细胞、血管内皮细胞、血管平滑肌细胞），进而加速创面愈合与修复，完成皮肤软组织缺损的重建，该研究结果将为今后临床上慢性创面的治疗提供新的思路。A、B:激光共聚焦显微镜显示观察归巢的干细胞及CD31α-SMA图Exosome+Wnt3a组大鼠术后第7、16天创面归巢的自体BMSCs数量，**P<0.01;C:免疫荧光染色的共定位，黄色表示已定向分化，红色表示未发生分化，蓝色为细胞核各组大鼠术后创面内源性间充质干细胞归巢及分化情况5Fig.5ThehominganddifferentiationofBMSCsforwoundrepairindifferentgroups+Wnt3a综上，本研究率先采用外泌体蛋白联合治疗慢性难愈性创面，体内及体外实验证实该联合疗法能够刺激机体动员内源性干细胞归巢，并于创面诱导干细胞分化为周细胞、血管内皮细胞及平滑肌细胞，促进创面肉芽组织成熟，增强创面血管化，为临床上治疗慢性创面提供了较好的选择。参考文献[1]EdwardsH，FinlaysonK，CourtneyM，etal.Healthservicepathwaysforpatientswithchroniclegulcers:identifyingef-fectivepathwaysforfacilitationofevidencebasedwoundcare[J].BMCHealthServRes，2013，13:86.谢承成，陈南，吴迪开放性骨折术后创面感染的病原菌及耐.万方数据[2]药性分析[J].实用骨科杂志，2018，24（8）:682-686.[3]SingerAJ，ClarkRA.Cutaneouswoundhealing[J].NEnglJMed，1999，341（10）:738-746.[4]HrabchakC，FlynnL，WoodhouseKA.Biologicalskinsubsti-tutesforwoundcoverandclosure[J].ExpertRevMedDe-vices，2006，3（3）:373-385.[5]LaiRC，ArslanF，LeeMM，etal.ExosomesecretedbyMSCreducesmyocardialischemia/reperfusioninjury[J].StemCellRes，2010，4（3）:214-222.[6]ArslanF，LaiRC，SmeetsMB，etal.Mesenchymalstemcell-derivedexosomesincreaseATPlevels，decreaseoxidativestressandactivatePI3K/Aktpathwaytoenhancemyocardial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蒙药山沉香护肝、抗氧化活性部位研究
目的研究蒙药山沉香不同提取物护肝、抗氧化作用，筛查山沉香具有护肝、抗氧化作用的活性部位。方法以浓度为乙醇回流提取山沉香粉末浓缩得到乙醇提取物浸膏，用水分散制成混悬液后按极性从小萃取，减压浓缩干燥后称质量用于药效学实验。将到大依次用石油醚、乙醚、乙酸乙酯、正丁醇按比例只雄性昆明种小鼠随机分成空白组（羧甲基纤维素钠花生油）、阳性对照组（联苯双酯）、山沉香乙醇部位提取物组、山沉香石油醚部位提取物组、山沉香乙醚部位提取物组、山沉香乙酸乙酯部位提取物组、山沉香正丁醇部位提取物组，每组次，连续灌胃）造成急性肝损伤模型，空白）、谷草转氨酶）含量，并观察肝组评分。结果与空白组比较，模型组小鼠体型偏瘦，毛发黯淡无含量明显升高）;模型组小鼠肝组织外观呈暗棕色，体积增大;病理切片表现）。与模型组比较，SOD含量明显降低（P<）含）。结醇提物的乙酸乙酯提取物组注射等量花生油。（织形态外观、切片病理特征及对其进行光且较稀疏，灵活度下降，容易聚堆;血清（P<为肝小叶中央静脉周围出现凝固性坏死、肝索肝窦排列不整齐山沉香乙醇提取物组和乙酸乙酯提取物组小鼠毛色光泽，体型较为丰满;血清0.01AST评分明显升高（P<0.010.01、（P<95%评分明显降低（P<100.1%CCl4-GPx），量明显升高;且该组肝组织形态外观与空白组接近，病理损伤有明显改善，论蒙药山沉香具有护肝作用，而且可通过抗脂质过氧化来保护肝脏，山沉香是其护肝、抗氧化的活性部位。关键词:山沉香;乙酸乙酯提取物;护肝;抗氧化;活性部位中图分类号:doi:A10.19378/j.issn.1003-9783.2020.03.006IshakALT0.01）;山沉香乙酸乙酯提取物组小鼠肝匀浆0.050.01（P<03-0281-06）、超氧化物歧化酶（1003-9783含量明显升高（P<含量明显降低（P<含量明显降低（P
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经直肠腔内超声在肛管直肠恶性黑色素瘤诊断中的应用价值
目的探讨经直肠腔内超声(TRUS)在肛管直肠恶性黑色素瘤(ARMM)术前诊断与肿瘤T分期中的应用价值。方法收集2008年2月至2019年4月在福建医科大学附属协和医院确诊,并且于病理取材前1周内行TRUS的19例ARMM患者(22个病灶)的临床与超声资料,总结其声像图特征,并根据病灶大小及生长方式不同进行超声分型,分析术前超声诊断与肿瘤分期的准确性。结果22个病灶中,6364%(14/22)病灶下缘距肛缘≤3cm,6818%(15/22)病灶形态较规则,8182%(18/22)边界较清晰,6364%(14/22)Adler血流分级为Ⅱ~Ⅲ级。术前TRUS诊断符合率为7368%(14/19),肿瘤T分期准确率为75%(12/16)。结论ARMM具有一定的声像图特征,TRUS术前诊断与T分期准确性较高,对临床制定诊疗方案具有重要
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围产期早期保健及营养指导对妊娠期糖尿病及早产的预防价值
目的]探讨围产期早期保健及营养指导对妊娠期糖尿病(GDM)及早产的预防价值。[方法]选择2016年7月至2018年3月在本院进行产检并最终在本院分娩的109例孕妇,按照随机数表法分为观察组(51例)和对照组(58例)。对照组孕妇在孕产期间接受常规化的保健宣教和健康指导,观察组孕妇则在上述基础上实行围产期早期保健及相应的营养指导,比较两组临床疗效,分析围产期早期保健及营养指导对GDM及早产发生的预防价值。[结果]两组的孕前体质量指数(BMI)比较差异无统计学意义(P>0.05),观察组分娩时BMI及孕期体质量增加幅度明显低于对照组,其差异有统计学意义(P<0.05)。孕前,两组的空腹血糖(FPG)、餐后2h血糖(2hPG)和血浆糖化血糖蛋白(HbA1C)水平比较无统计学意义(P>0.05);观察组孕前和分娩时FPG、2hPG和HbA1C水平比较未见明显变化(P>0.05);对照组分娩时FPG、2hPG和HbA1C水平明显高于孕前(P<0.05)。观察组的GDM和早产儿发生率分别为3.45%、3.45%,均明显低于对照组(分别为19.61%、21.57%),组间差异比较有统计学意义(P<0.05)。[结论]围产期间实行早期保健及相应的营养指导,能够使孕妇的BMI及血糖水平得到有效控制,从而能够有效预防和减少GDM等妊娠并发症及早产儿等不良妊娠结局的发生。[关键词]糖尿病,妊娠/预防与控制;预防医学;营养疗法;围产期PreventiveValueofEarlyPerinatalHealthCareandNutritionalGuidanceforGestationalDia-betesMellitusandPrematureGeliveryQIAOLing(DepartmentofObstetricsandGynecology,MeishanMaternalandChildHealthHospital,Sichuan620010)[Abstract][Objective]Toexplorethevalueofearlyperinatalhealthcareandnutritionalguidanceinthepreventionofgestationaldiabetesmellitus(GDM)andprematuredelivery.[Methods]OnehundredandninepregnantwomenwhounderwentmaternityexaminationinourhospitalfromJuly2016toMarch2018ande-ventuallydeliveredinourhospitalweredividedintoobservationgroup(51cases)andcontrolgroup(58cases)accordingtorandomnumbertablemethod.Pregnantwomeninthecontrolgroupreceivedroutinehealtheduca-tionandhealthguidanceduringpregnancyandchildbirth,whilepregnantwomenintheobservationgroupre-ceivedearlyperinatalhealthcareandcorrespondingnutritionalguidanceonthebasisoftheabove.Theclinicalefficacyofthetwogroupswascompared,andthepreventivevalueofearlyperinatalhealthcareandnutritionalguidanceforGDMandprematurebirthwasanalyzed.[Results]Therewasnosignificantdifferenceinbodymassindex(BMI)beforepregnancybetweenthetwogroups(P>0.05).TheincreaseofBMIandbodymassduringpregnancyintheobservationgroupwassignificantlylowerthanthatinthecontrolgroup(P<0.05).Therewasnosignificantdifferenceinthelevelsoffastingbloodglucose(FPG),postprandial2-hourbloodglu-cose(2hPG)andplasmaglycosylatedglycoprotein(HbA1C)betweenthetwogroupsbeforepregnancy(P>0.05);therewasnosignificantchangeinthelevelsofFPG,2hPGandHbA1Cbeforepregnancyandduringdeliveryintheobservationgroup(P>0.05);thelevelsofFPG,2hPGandHbA1Cduringdeliveryinthecontrolgroupweresignificantlyhigherthanthosebeforepregnancy(P<0.05).TheincidenceofGDMandprematureinfantsintheobservationgroupwere3.45%and3.45%respectively,whichweresignificantlylow-erthanthoseinthecontrolgroup(19.61%and21.57%,respectively).Thedifferencebetweenthetwogroupswasstatisticallysignificant(P<0.05).[Conclusion]EarlyhealthcareandnutritionalguidanceduringperinatalperiodcaneffectivelycontrolBMIandbloodsugarlevelofpregnantwomen,thuseffectivelypreventandre-ducepregnancycomplicationssuchasGDMandadversepregnancyoutcomessuchasprematureinfants.[Keywords]Diabetes,Gestational/PC;PreventiveMedicine;NutritionTherapy;PeripartumPeriod[中图分类号]R714.256[文献标识码]A[doi:10.3969/j.issn.1671-7171.2019.06.020][文章编号]1671-7171(2019)06-1100,1105-04早期保健及相应的营养指导能够使孕妇在孕产期间观察组孕妇在上述基础上实行围产期早期保健医学临床研究2019年6月第36卷第6期JClinRes,Jun.2019,Vol36,№6妊娠期糖尿病(GDM)是指孕妇在妊娠期间发生不同程度的糖耐量异常,往往会对其肾脏功能造成不良影响[1]。GDM若得不到有效控制,不仅会增加其他妊娠并发症发生的概率,同时还会导致胎儿宫内过度生长而形成巨大儿[2],增加早产、宫内窘迫的发生率,对母婴生命安全造成严重威胁。围产期的血糖水平得到有效控制,降低妊娠并发症及不良妊娠结局的发生[3]。本研究在围产期间对孕妇实行早期保健及相应的营养指导干预,取得了较好的临床疗效,现将结果报道如下。1资料与方法1.1一般资料选取2016年7月至2018年3月在本院进行产检并最终在本院分娩生产的109例孕妇,所有孕妇在孕前均未伴有高血压、糖尿病等慢性疾病,且均无精神疾病病史。109例孕妇按随机数表法分为观察组(51例)和对照组(58例)。观察组:年龄(28.51±4.23)岁,孕次(1.64±0.38)次,其中初产妇33例、经产妇18例。对照组:年龄(28.43±4.18)岁,孕次(1.55±0.41)次,初产妇36例、经产妇22例。两组孕妇年龄、孕次等一般资料比较无统计学意义(P>0.05)。本研究经本院医学伦理委员会批准,所有孕妇均知情同意。1.2方法对照组孕妇在孕产期间接受常规化保健宣教和健康指导,并定期对孕妇的体质量进行测定,评估其体质量是否处于合适的生长范围[BMI<18.5时,孕期体质量增加不超过13kg;BMI在(18.5~25)kg/m2,孕期体质量增加在8~10kg;BMI在25~30,孕期体质量增加5~7kg],根据孕妇的实际情况指导其进行合理的饮食和运动。及相应的营养指导。⑴孕产期早期保健:孕产期早期向孕妇发放孕期保健宣传资料,并为其建立孕产期保健档案。每月定期组织孕妇来院参加孕产期健康教育培训班,培训内容包括孕期所需营养,饮食搭配,日常工作、生活、学习指导,孕期心理调节,自我检测,妊娠期并发症的具体表现及应对措施,早产征象及如何避免早产的发生,分娩征兆及产时保健,产休室、产房环境及联系方法,目的是通过规范化的健康教育帮助孕妇顺利完成“接受、认知、参与、自主行动”的过程,使孕妇充分了解妊娠、分娩的生理过程,知晓妊娠的病理风险,消除恐惧、焦虑心理。定期对孕妇及胎儿进行常规产科检查,做好孕期相关并发症的预防工作,从妊娠期20周开始,根据孕妇宫底·1011·高度为其绘制“妊娠图”,借助妊娠图、BMI以及B超所示双顶径大小对胎儿发育情况进行了解。对于畸形发育严重的胎儿,可及时终止妊娠。孕产期间,根据孕妇的实际情况给予营养、用药、生活、运动、心理等相关方面的指导,以帮助孕妇顺利渡过孕产期。(2)个性化营养指导:根据孕妇的血糖水平、孕前体质量、孕期增重以及运动强度消耗等具体情况确定总热能的摄入量,结合每名孕妇的BMI、营养状况、饮食习惯对其进行相应的孕期营养指导,为其制定个性化的饮食计划。饮食计划遵循:①少食多餐,每日保证5~6次;②忌食生冷、辛辣;③多食蔬菜水果,绿色蔬菜每日摄入不少于250g,水果以低糖分的新鲜水果为主;④多食用富含膳食纤维、维生素、蛋白质、各类矿物质以及低胆固醇的食品。个性化营养指导实行期间,对孕妇的每日营养摄入情况进行调查分析,包括所食食物种类、质量以及饮食餐次等,并对孕妇每日所进食食物的营养成分进行计算,推算孕妇的热量、蛋白质、维生素以及各种矿物质等营养成分的每日摄入量是否达标。同时定期对孕妇的BMI、血糖水平等情况进行测定,根据实际情况及时调整饮食计划。(3)孕产期运动指导:孕产期间由本院康复科医师负责,根据孕妇的运动耐受性为其制定个性化的孕产期运动方案,以有氧运动为主。运动期间严格控制运动量,运动心率控制在(220-年龄)×65%以下为宜,以避免剧烈运动导致意外发生。每日运动结束后,叮嘱孕妇对血压、血糖、心率进行自我监测,并按时定期来院进行产检。1.3观察指标比较两组孕妇孕前BMI、分娩时BMI及孕期增重。孕前、分娩时分别抽取两组孕妇的清晨空腹静脉血5mL,检测空腹血糖(FPG)、餐后2h血糖(2hPG)和血浆糖化血糖蛋白(HbA1C)水平。比较两组孕妇GDM、羊水过多、产褥感染、子痫前期、妊娠肝内胆汁淤积症(ICP)、妊娠期高血压等妊娠相关并发症的发生情况,分析两组孕妇的早产儿、巨大儿、宫内窘迫、新生儿低血糖、新生儿窒息、产后出血、胎膜早破等不良妊娠结局。1.4统计学分析数据均采用SPSS22.0软件处理,计量资料以均数±标准差(x±s)表示,采用方差分析,计数资料用率(%)表示,采用χ2检验,P<0.05为差异有统计学意义。2结果2.1两组孕妇的体质量比较两组孕妇的孕前BMI比较差异无统计学意义(P>0.05),观察组分娩时BMI及孕期增重明显低于对照组,其差异有统·2011·计学意义(P<0.05),见表1。表1两组孕妇的体质量比较(x±s)组别病例数5158观察组对照组tP孕前BMI(kg/m2)22.44±4.1322.51±4.080.08890.9294分娩时BMI(kg/m2)26.57±4.4930.31±5.144.01950.0001(kg)15.38±3.0319.17±3.86孕期增重5.64620.0000等妊娠并发症及早产儿等不良妊娠结局的发生概率医学临床研究2019年6月第36卷第6期JClinRes,Jun.2019,Vol36,№6导使孕妇对碳水化合物、蛋白质、维生素、蛋白质、矿物质和膳食纤维的摄入更加均衡[10],各种营养物质的吸收更加合理。因此,实行围产期早期保健和营养指导的孕妇,在孕产期的体质量增加幅度及分娩时BMI均明显低于给予常规化保健宣教和健康指导的孕妇。同时,其各项血糖指标水平也比常规健康指导的孕妇更加稳定。另外,个性化的营养指导及相应的孕产期运动指导,能够使孕妇在孕产期间的体质状况更好,机体免疫抵抗能力更强[11],GDM更低。本研究结果显示,围产期间行早期保健及营养指导的孕妇,其GDM和早产儿发生率均明显低于行常规保健宣教和健康指导的孕妇。另外,本研究在孕产期间给予孕妇以实行围产期早期保健,以帮助孕妇充分了解和认识妊娠、分娩的整个生理过程。知晓、理解妊娠期间存在的各项病理风险,以消除其对妊娠过程的恐惧、焦虑心理,使孕妇能够积极配合完成早期保健和营养指导,提高了孕妇的依从性,进而使其顺利渡过整个妊娠过程,这对于减少和降低妊娠并发症、改善妊娠结局具有重要意义[12]。此外,借助科学、规范化的产科检查能够及时发现、处理存在的合并症及并发症,做到早发现、早干预、早治疗[13]。综上所述,围产期间实行早期保健及相应的营养指导,能够使孕妇的BMI及血糖水平得到有效控制,从而能够有效预防和减少GDM等妊娠并发症以及早产儿等不良妊娠结局的发生。[参考文献][1]李亚冬,马立萍.医院社区整体血糖管理模式对妊娠糖尿病患者血糖控制的效果研究[J].中国全科医学,2015,18(4):439-442.[2]陆彩华,张红.孕期营养指导对妊娠期糖尿病病人妊娠结局的影响[J].青岛大学医学院学报,2015,51(1):105-106.[3]王洪梅,刘金华,陈莲花,等.针对性系统护理对妊娠糖尿病患者妊娠结局的影响研究[J].现代中西医结合杂志,2016,25(11):1233-1235.[4]何燕,聂禄娟,张艳.连续性护理干预对妊娠糖尿病患者母婴结局的影响[J].实用临床医药杂志,2016,20(6):108-110.[5]郭美英,李玉梅,刘冬菊,等.妊娠期糖尿病孕妇个体化营养干预的效果观察[J].护理学报,2015,22(18):52-55.[6]陈玉华.不同医学营养方案对妊娠糖尿病患者血糖影响的对比[J].安徽医药,2015,19(6):1135-1137.[7]洪忠新,丁冰杰.个体化饮食治疗是妊娠糖尿病治疗的基石[J].中国全科医学,2015,18(14):1608-1613.[8]贾晓炜,赵鑫,张颖,等.妊娠糖尿病患者饮食自我管理与个体化干预研究[J].重庆医学,2015,44(03):327-328.(下转第1105页)孕前分娩时孕前分娩时组别n观察组51对照组582.2两组孕妇围产期间血糖水平比较孕前,两组孕妇的FPG、2hPG和HbA1C水平比较无统计学意义(P>0.05);观察组在孕前和分娩时的FPG、2hPG和HbA1C水平比较未见明显变化(P>0.05);对照组分娩时FPG、2hPG和HbA1C水平明显高于孕前(P<0.05),见表2。2hPG(mmol/L)6.11±0.586.26±0.716.14±0.566.81±0.62FPG(mmol/L)5.43±0.455.54±0.335.38±0.436.07±0.38表2围产期间两组孕妇的血糖水平比较(x±s)HbA1C(%)5.18±0.415.24±0.355.23±0.435.75±0.412.3两组孕妇的GDM及早产儿发生率比较观察组的GDM和早产儿发生率分别为3.45%(2/51)、3.45%(2/51),均分别明显低于对照组的19.61%(10/58)、21.57%(11/58),其差异有统计学意义(χ2=4.9144,P=0.0266;χ2=5.8470,P=0.0156)。3讨论研究发现,孕产期体质量若得不到有效控制,孕产期BMI过高往往会导致孕产期间血糖过高[4],进而诱发GDM等妊娠并发症的发生。孕妇处于高血糖状态时,通常会出现毛细血管管管壁、基底膜增厚[5],造成血管管腔狭窄,不仅增加了妊娠高血压等一系列妊娠并发症的发生,同时还会因供血不足对肾脏功能造成损伤[6]。介于上述多种因素的综合性作用,不仅对胚胎的正常生长发育和胎盘功能造成不良影响,同时胰岛素抵抗、高胰岛素血症还能够对脂肪分解起到抑制作用[7],从而导致孕早期流产、早产儿、巨大儿、宫内窘迫等一系列不良妊娠结局发生的概率大大增加。因此,围产期间做好GDM的预防工作对于降低分娩风险、减少相关并发症及不良妊娠结局的发生至关重要。围产期间积极控制孕妇的血糖、体质量是预防GDM发生的有效手段[8],科学化、合理化的饮食计划则可有效控制孕妇的血糖、体质量[9]。为此,本研健及相应的营养指导干预,个性化、精细化的营养指究对在本院进行定期产检的孕妇实行围产期早期保质细胞瘤患者术后伴有语言或运动功能障碍者的生肿瘤同时避免神经功能受损对患者生存预后至关重[参考文献]在脑功能区胶质细胞瘤手术中能够明确胶质细胞瘤·5011·互弥补,提高手术定位的准确性。患者术后恢复情况观察发现,观察组患者术后语言、运动及感觉功能恢复良好,提示,吲哚菁绿染色联合电生理监测对肿瘤病灶的定位较准确。综上所述,吲哚菁绿荧光染色联合电生理监测内部的关系,有助于保护神经功能,可提高肿瘤切除程度。医学临床研究2019年6月第36卷第6期JClinRes,Jun.2019,Vol36,№6P=0.147)比较,差异无统计学意义(P>0.05),两组患者运动功能(χ2=4.582,P=0.032)、感觉功能(χ2=6.127,P=0.047)比较,差异有统计学意义(P<0.05)。3讨论研究显示[5],胶质细胞瘤手术切除程度越高,患者生存时间越长,且胶质细胞瘤患者术后生活质量同样影响患者生存时间。SaitoT等[6]研究发现,胶[1]TanigawaN,MatsumuraM,AmayaH,etal.Tumorvascu-存时间明显短于无神经功能障碍者。因此,在切除laritycorrelateswiththeprognosisofpatientswithesophagealsquamouscellcarcinoma[J].Cancer,2015,2:220-225.要。目前临床应用于胶质细胞瘤治疗的方法有术中[2]BurleyTA,MᶏczyńskaJ,ShahA,etal.Near-infraredphoto-导航、术中MRI及皮质刺激等多种方案,术中导航immunotherapytargetingEGFR-sheddingnewlightonglio-blastomatreatment[J].IntJCancer,2018,11:2363-2374.受脑脊液流失影响,常导致病灶定位偏差,而术中[3]张玉海,刘宏毅,张锐,等.多模态影像联合电生理监测在脑功MRI成像操作繁琐且价格昂贵,并在一定程度上受能区胶质瘤手术中的应用研究[J].临床神经外科杂志,2016,到操作者的经验影响,皮质电刺激等需要患者术中13(5):335-339.配合,因此难度较大。吲哚菁绿是常用的荧光标记[4]王伟,廉海平,王拓,等.脑运动功能区病变患者术中采用神经物,其作为近红外荧光染料在生命科学和生物医学电生理监测对其预后评估的作用[J].第三军医大学学报,2017,39(16):1664-1668.研究中具有重要的研究价值。[5]WoodwardDE,CookJ,TracquiP,etal.Amathematicalmodelofgliomagrowth:theeffectofextentofsurgicalresec-瘤组织并蓄积,呈现荧光。本研究采用高剂量吲哚tion[J].CellProlif,2017,6:269-288.菁绿引导胶质细胞瘤切除结果显示,观察组肿瘤全[6]SaitoT,MuragakiY,MaruyamaT,etal.Difficultyinidenti-切率为84.31%,与既往文献[7]报道的全切率80%ficationofthefrontallanguageareainpatientswithdominanttriangularis[J].Jfrontalgliomas相近,提示吲哚菁绿染色能够引导脑胶质细胞瘤切Neurosurg,2016,125(4):803-811.除。本研究中脑胶质细胞瘤主要位于语言、运动及[7]GlundS,MattheusM,RungeF,etal.Relativebioavailability感觉区域,应用吲哚菁绿染色联合电生理进行引导ofanempagliflozin25-mg/linagliptin5-mgfixed-dosecombina-切除治疗取得良好效果,结果与MansfieldKE等[8]tiontablet[J].IntJClinPharmacolTher,2017,55(4):355-研究基本一致。笔者认为两者联合不仅能够定位功367.[8]MansfieldKE,JuliusS,JordanJL,etal.Asystematicre-能区,还可以实时检测功能区信号传导通路的完整viewandmeta-analysisoftheprevalenceofchronicwidespread性,且应用吲哚菁绿染色定位病灶,克服了电生理监paininthegeneralpopulation[J].Pain,2016,157(1):55-64.测不能在麻醉状态下定位感觉皮层的缺点,两者相(本文编辑:张兴珍)[收稿日期]2019-01-11■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■(上接第1102页)4616-4618.[12]季华,姜伟.妊娠期营养对妊娠期糖尿病母婴结局的影响[J].[9]王颖,顾平,朱珠.运动和饮食控制法对妊娠期糖尿病孕妇血医学临床研究,2017,34(6):1124-1127.糖和妊娠结局影响分析[J].中国妇幼保健,2015,30(21):[13]党玮,同慧莉,苟文丽.妊娠前与妊娠中期体质量状况对妊娠3575-3577.糖尿病发病的影响[J].医学临床研究,2015,32(12):2461-[10]张泽琛,滕越,王杰,等.营养干预对妊娠期糖尿病患者体重与2463.妊娠结局的影响[J].卫生研究,2016,45(2):337-340.(本文编辑:邓丽萍)[收稿日期]2018-08-01[11]陈妮,谢立华,焦杰华,等.饮食运动指导对孕前超重肥胖孕妇妊娠期糖尿病的预防作用[J].中国妇幼保健,2017,32(19):吲哚菁绿染色能够透过肿瘤破坏的屏障进入肿thatinvolvethepars
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饮食或遗传所致胰岛素抵抗小鼠Toll样受体5表达的对比研究
目的研究饮食或遗传所致胰岛素抵抗小鼠Toll样受体5（TLR5）的表达。方法m/m小鼠（糖脂代谢正常的C57BL/KsJ小鼠）经高脂喂养18周，成功筛选出6只小鼠由高脂饮食诱导胰岛素抵抗模型为m/m-HFD组，随机从正常饮食喂养18周的正常对照组和遗传因素所致胰岛素抵抗组(有基因缺陷的C57BL/KsJ小鼠)中各抽取6只作为m/m-NCD组和db/db组。收集组织样本，采用westernblot技术检测回肠样本TLR5的表达，ELISA检测血清样本中炎症因子IL-6、IL-10的水平。结果干预18周后，与m/m-NCD组相比，m/m-HFD和db/db组小鼠血样中糖脂、胰岛素水平均升高，差异有统计学意义（P<0.05）。成模的小鼠QUICKI<0.339,HOMA-IR>2.69,db/db组胰岛素抵抗大于m/m-HFD组;与m/m-NCD组相比,m/m-HFD和db/db组小鼠回肠样本中TLR5表达均增加，差异有统计学意义(P<0.05);与m/m-NCD组相比,m
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直肠神经内分泌肿瘤非治愈性切除患者的临床转归
目的评价经内镜切除的直肠神经内分泌肿瘤(RNETs)伴淋巴血管(LV)浸润或切缘阳性患者的临床转归。方法回顾性分析2011年1月至2018年12月44例于首都医科大学附属北京友谊医院治疗的存在LV浸润或切缘阳性的RNETs患者的临床资料。结果385例RNETs患者中，44例病理确诊为RNETs伴LV浸润或切缘阳性，其中男性25例，女性19例，中位年龄57.5岁(范围30~80岁)。病变完整切除率为87.01%(335/385)。肿瘤直径为1~13mm，中位值为5.5mm;38个肿瘤直径<10mm。36例采用内镜黏膜下剥离术(ESD)，5例为内镜下黏膜切除术(EMR)和3例为经肛内镜显微手术(TEM)。病理表现为G1级40例，G2级4例。术后病理提示肿瘤垂直切缘阳性31例(26例为ESD，5例为EMR)，水平及垂直切缘均阳性4例(均为ESD);LV浸润5例(均为ESD)，垂直切缘阳性且LV浸润4例(均为ESD)。3例垂直切缘阳性或LV浸润的患者接受TEM作为补救治疗，术后病理未见肿瘤残留;其他41例患者接受内镜监测，无复发病例。随访7~74个月，中位值为24个月，所有患者均未出现淋巴结或
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中医传统运动在糖尿病防治中的应用
近年来糖尿病的发病率逐年上升，运动疗法作为糖尿病基础治疗方法，是糖尿病治疗中不可或缺的五架马车之一。具有浓厚中医学理论基础的中医传统运动项目，如八段锦、太极拳、五禽戏和易筋经，在糖尿病运动干预疗法中正逐步得到应用。现代研究发现，中医传统运动在改善糖尿病危险因素、调节血糖、延缓并发症发生等方面收到较好疗效，适宜进一步推广并深入研究。
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母乳喂养中的常见问题与解决方案
母乳喂养是全世界公认的婴儿最为理想的食物。如何掌握母乳喂养的要点、知晓主要的影响因素、发现和正确处理在母乳喂养过程中母亲和婴儿出现的相关问题，对儿科临床实践非常重要，对提升我国母乳喂养率也具有极大的促进作用。DOI:IO.3760/cma.j.issn.0578-1310.2019.01.019母乳喂养是公认的婴儿最为理想的食物。1岁以内是人一生中生长发育的第一个高峰期，合理的母乳喂养是儿童近期发育与远期健康的重要保证。母乳可以提供全面、而不是向外突出。乳头扁平是既不回缩也不伸出，保持平坦。未压缩时，一些内陷的乳头看起来正常，可以轻轻按压乳晕，离乳头2~4cm的距离，看是否存在以上情况。需要优质、充足和结构适宜的各类营养素，满足婴儿的生长发育需求，并且能完美地适应婴儿尚未成熟的消化能力，促进各器官的发育及功能的成熟，是婴儿从脱离母体后顺利适应自然的生态环境生存并健康成长的最好食物。母乳的主要成分为乳糖、易消化的乳清蛋白和酪蛋白、必需脂肪酸以及免疫球蛋白如分泌型IgA，能全部满足婴儿所需的营养配指出的是，母乳喂养是乳晕喂养，而不是乳头喂养，有乳头内陷或扁平情况的母亲并不影响哺乳。不建议孕期进行乳头牵拉或使用乳头内陷矫正器[2]。2.乳头疼痛和乳头皲裂:是常见的母乳喂养并发症，主要原因在于不正确的含接姿势以及婴儿的位置。另外还需警惕乳管阻塞、供大于求、皮肤病和血管痉挛。58%的乳头置，促进神经系统发育，也能预防多种疾病如中耳炎、过敏、疼痛经过调整含接姿势及婴儿的位置就能得到解决。乳头胃肠道感染、肺炎、哮喘，还能降低远期罹患肥胖症、糖尿病、白血病等的风险。而对于母亲，可以促进子宫收缩、恢皲裂引起的疼痛常见于第1周的磨合阶段，不会造成长期的疼痛或不适，正确的含接姿势可预防皲裂，试着每次喂奶复体型，降低产后抑郁、乳腺癌、卵巢癌、高血压、心血管疾病和2型糖尿病的发病风险。全世界的主要健康组织都建议母乳喂养作为婴儿营养的最佳来源，出生后的前6个月的时候变换婴儿的姿势，尽可能将乳房暴露在空气中晾晒，不要佩戴塑料保护膜或带有塑料层的防溢乳垫，每次哺乳后挤出几滴乳汁，涂抹在乳头上并自然风干。天气干燥时进行纯母乳喂养，6个月后引人过渡期食物。大多数组织建可以擦一些提纯的低敏绵羊油。多数情况下乳头疼痛只是议母乳喂养至少1年，世界卫生组织(wHO)建议至少2年。暂时性问题，不会妨碍母乳喂养的成功率b]。一、关于母乳喂养的定义广义的母乳喂养包括生母用乳汁喂养、奶妈或其他乳3.掌握正确的母乳喂养方法:通过婴儿吸吮可以预防乳房充血肿胀，但针灸、超声、刮痧、穴位按压、冷敷、热敷对母的乳汁喂养以及人乳库的乳汁喂养。纯母乳喂养即婴儿乳房充血肿胀的疗效均不确定，应以预防为主，必要时可以仅以母乳喂养，无其他任何液体和固体食物甚至水，但不包依据不同的经验治疗。哺乳时热敷，哺乳后冷敷也有助于括维生素或矿物质补充剂和药物滴剂或糖浆。部分母乳喂缓解胀痛。养为除母乳外婴儿尚有其他食物，包括乳类制品…。4.乳腺炎:是指当乳汁没有充分排出时，细菌可能会在二、母乳喂养中的常见问题(一)乳房问题该乳房区域生长并导致感染。症状包括乳房肿胀、灼热、皮肤发红或疼痛，可伴有发热、流感样症状或全身疼痛。应及1.乳头内陷:是指当乳晕被轻轻挤压时，乳头向内回缩时寻求乳腺外科医生的专科治疗。治疗方法包括排空乳房、万方数据·76·休息、镇痛等对症支持治疗，必要时使用抗菌药物。不严重时可以直接乳房喂养，当症状严重、发热、怀疑菌血症或败血症、乳房脓肿等情况需暂停乳房喂养，但应排空乳房[4]。(--)帮助母亲建立和延长母乳喂养的策略出生时的皮肤接触、早期开始母乳喂养、家庭的哺乳支持、爱婴医院倡议(BFm)以及母乳喂养健康教育的专业建议对于母乳喂养的开始和继续非常重要。专业的面对面指导支持比电话支持更为有效，并能延长母乳喂养时间[4]。性体重下降如超过10%应警惕可能为母乳摄入不足导致。婴儿体格增长速率可以用来衡量母乳摄人情况，评价方法可参考“中国儿童体格生长评价建议”[7]。新生儿胎粪转黄时间和尿量可以间接用于评估母乳喂养的有效性[5]。足月健康新生儿粪便转黄时间为3~15d，如胎粪转黄延迟提示母乳量不足[4]。《实用儿童保健学》指出新生儿如尿量不足E
8次/24h)有助于预防母乳相关性黄疸的发生，诊断母乳性黄疸的婴儿不应该中断母正确的含接姿势应该是让婴儿的头和身体呈一条直乳喂养。诊断为母乳性黄疸的婴儿可参考“新生儿高胆红线，婴儿身体贴近母亲，头和颈部得到支撑，尽量贴近乳房，鼻子面向乳头，婴儿张大口含住乳头和乳晕，上嘴唇盖住的乳晕少于下嘴唇，下唇向外突出，下颌接触乳房。可以使用到LA代H母乳喂养评分系统来评估是否有效含接[4]。如果以往有不成功的母乳喂养经历会降低之后的母乳喂养率，这些母亲更需要提供专业的母乳喂养支持。(三)评估喂养是否充足的最佳方法素血症诊断和治疗专家共识”中光疗参考曲线抉择是否需要光疗，使用光疗治疗的婴儿允许在间歇期母乳喂养[9]。2.牛奶蛋白过敏:牛奶蛋白过敏是3岁以下婴幼儿食物过敏的主要原因。母乳喂养的婴幼儿发生牛奶蛋白过敏时，建议在母亲回避牛奶及奶制品摄人的情况下继续母乳喂养，但母亲应同Be,I,充钙剂(钙元素800~1000mg/d)。必要时应寻求专业的饮食咨询以排除隐藏的牛奶蛋白来源并评估喂养是否充分的最佳方法是通过测量体重和在访确保母亲的营养需求。对有症状的(如严重的特应性皮炎、视期间的排便量来监测婴儿的体重增长。采用生长曲线监过敏性结肠炎并发生长迟缓或低蛋白血症、严重贫血等)母测婴儿体重增长速率是衡量母乳摄人量的重要标准。乳汁乳喂养婴儿，可以喂食治疗配方奶一段时间，但最多2周。的分泌取决于充分的乳房刺激和排空乳房，挑剔的婴儿、不如母亲已严格无牛奶蛋白饮食仍有症状的婴儿应进一步转太丰满的乳房常常会误导母亲感知母乳的不足，但这并非诊至专科咨询[8]。真实的母乳不足。感知不足往往导致不必要的配方奶喂养。可靠的方法是喂食前后在相同条件下称重婴儿的衣服，然后将喂食后的体重减去喂食前的体重，据估计，lg的体重增加相当于1ml的牛奶摄人量[4]。出生l周内的生理3.新生儿低血糖:早吮吸和早接触可以降低新生儿低血糖的发生风险[5]。新生儿出生24h内血糖水平应持续>2.5mmol/L，出生>24h血糖水平应持续>2.8mmol/L，低于上述水平则为低血糖。其中高危儿应在出生lh内监测血糖，万方数据史堡』!型銎查!Q!!生!旦箜!!鲞箜!塑垦!尘!旦型i坐!』婴!!翌!!!!!!!!:!!!№:!·77·之后每隔1-2h复查，直至血糖浓度稳定。高危儿是指:(1)胰岛素依赖型糖尿病或妊娠糖尿病母亲的新生JL;(2)出生体重>4kg或<2kg的新生儿;(3)大于胎龄儿(出生胎龄别体重>第90百分位)、小于胎龄儿(<第10百分位)或宫内生长受限新生儿;(4)胎龄<37周的新生儿;(5)应用平喘药特布他林或B受体阻滞剂母亲的新生儿;(6)具有肝大、头小畸形、面部及中枢神经系统前中线畸形、巨体、巨舌或偏侧肢体肥大等体征的新生JL;(7)疑患先天性代谢性疾病新生儿。无症状低血糖新生儿可以继续母乳喂养(每次间隔1-2h)或按l~3ml/kg(最高不超过5ml，kg)喂养挤出的母乳或捐赠人乳，如喂养后血糖水平仍然很低，应立即进行葡萄糖静脉输注治疗，在此期间仍可继续进行母乳喂养。如有临床症状或血糖<2.6mmol/LIt寸可以静脉输注葡萄糖。起始量按10%葡萄糖2ml/kg，以1ml/min静脉推注，而后以6~8ml/(kg·min)静脉滴注维持，并于20~30min后复测血糖，之后每小时复测1次直至血糖稳定№]。[8]KoletzkoS，NiggemannB，AratoA，eta1.DiagnosticapproachandmanagementofCOW7S-milkproteinallergyininfantsandchildren:ESPGHANGICommitteepracticalguidelines[J].JPediatrGastroenterolNutr，2012，55(2):221-229.DOh10.1097/MPG.0b013e31825c9482.[9]中华医学会儿科学分会新生儿学组，《中华儿科杂志》编辑委员会.新生儿高胆红素血症诊断和治疗专家共识[J]中华儿科杂志，2014，52(10):745.748.DOh10.3760/cma.i.issn.0578.1310.2014.10.006.选择题(单选):1.哪个方法不推荐用来帮助母亲建立和延长母乳喂养A.出生时的皮肤接触B.早期开始母乳喂养c.爱婴医院倡议D.咨询长辈、朋友、网页喂养经验E.家庭支持2.评估母乳是否充足以下什么方法不当?母乳是最为理想的婴儿天然食物，为母亲和儿童带来A.生长曲线图许多益处。促进母乳喂养对儿童生长发育至关重要，也有B.胎粪转黄的时间着重要的社会意义。早吮吸、早期皮肤接触，指导正确的含接喂养姿势，机构的专业指导以及家庭支持都对促进母乳c.生理性体重下降的持续时间和程度D.将母乳挤出来计算体积喂养至关重要。正确处理婴儿体重增长不足、母乳相关性E.儿童喂养前后称重法黄疸、牛奶蛋白过敏、新生儿低血糖等均能有效延长母乳喂养的时间。利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突3.世界卫生组织促进母乳喂养成功的十条措施不包括A.不要给母乳喂养的婴儿提供人工奶嘴或奶嘴(也称为安抚奶嘴)B.按需喂养参考文献C.向母亲展示母乳喂养以及如何保持哺乳，即使她们[l]陈荣华，赵正言，刘湘云.儿童保健学[M].5版.南京:江苏凤凰科学技术出版社.2017:73.74.[2]Preparingforbreastnon-protraetilenipplesfeeding:treatmentofinvertedandpregnancy.TheMAINTrialin[3][4]4CollaborativeGroup[J].Midwifery，1994，10(4):200·214.MeekJY，TippinsS.AmericanAcademyofPediatricsnewmother`Sguidetobreasffeeding[DB/OL].200212018-11-151.https:gwww.heahhychildren.orgIEnglish}ages-stagesbabybreastfeeding/Pages/Treating-Breast-Pain.aspx.WesterfieldKL，KoenigK，OhR.Breastfeeding:commonquestionsandanswers[J].AmFamPhysician，2018，98(6):368-373.[51中华医学会儿科学分会儿童保健学组，中华医学会围产医学分会，中国营养学会妇幼营养分会，等.母乳喂养促进策略指南(2018版)[J].中华儿科杂志，2018，56(4):261-266.DOh[6]10.3760/cmad.issn.0578-1310.2018.04.005.WorldHealthOrganization.Protecting，promotingandsupportingbreastfeedinginfacilitiesprovidingmaternityandnewbornservices[DB/OL].201712018.11.151.http://www.who.int/elena/titles/full_recommendations/breastfeeding-support/en.[7]《中华儿科杂志》编辑委员会，中华医学会儿科学分会儿童保健学组.中国儿童体格生长评价建议[J].中华儿科杂志，2015，53(12):887-892.DOI:10.3760/cma.j.issn.0578-1310.2015.12.003.与婴儿分开D.出生后为预防低血糖可以给新生儿进食一些糖水E.母婴同室--让母亲与婴儿每天24/b时保持在一起4.牛奶蛋白过敏的婴儿以下哪项措施不恰当:A.不建议选择羊奶、驴奶替代B.母亲应回避奶及奶制品C.母亲回避牛奶及其制品后应继续母乳喂养D.有严重牛奶蛋白过敏并发症时停止母乳喂养更换为氨基酸奶粉直至6-9月龄E.母亲在回避牛奶制品的同时应继续口服补充钙剂5.不正确的含接姿势是:A.婴儿的头和身体呈一条直线B.婴儿身体贴近母亲，头和颈部得到支撑C.尽量贴近乳房，鼻子面向乳头，婴儿张大口含住乳头和乳晕D.上嘴唇盖住的乳晕少于下嘴唇，下唇向外突出，下颌接触乳房E.下嘴唇盖住的乳房少于上嘴唇，下唇回缩，下颌远离乳房(收稿日期:2018-11-15)(本文编辑:李伟)万方数据
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