肝移植术后人类细小病毒B19感染的二代测序筛查及其相关危险因素分析
【摘要】 目的总结肝移植术后人类细小病毒（HPV）B19感染的筛查方法并分析相关危险因素。方法回顾性分析86例受者的临床资料。根据二代测序（NGS）结果分为HPVB19感染组和对照组，分析HPVB19感染患者的临床特点、治疗方案及预后，采用单因素和多因素Logistic回归向前LR逐步法分析HPVB19感染的危险因素。结果86例受者中9例受者肝移植术后2周左右出现不明原因发热伴进行性贫血，NGS检测提示HPVB19阳性，诊断为HPVB19感染引起的纯红细胞再生障碍性贫血（PRCA）。所有患者给予静脉注射用免疫球蛋白（IVIG）治疗及免疫抑制方案调整后，血红蛋白水平明显回升。多因素分析结果显示，患者术后7d外周血清球蛋白水平低[比值比（OR）=0.749，P=0.040]、年轻患者（OR=0.937，P=0.038）是肝移植术后HPVB19感染的独立危险因素。结论对于肝移植术后早期出现不明原因的血红蛋白水平下降的相对年轻患者，需考虑HPVB19感染。NGS筛查是早期诊断HPVB19感染的有效方法。患者术后7d外周血清球蛋白水平低和年龄（年轻患者）可能是其发生的独立危险因素。[关键词]肝移植;人类细小病毒B19;纯红细胞再生障碍性贫血;二代测序;危险因素;感染;免疫排斥反应;心脏死亡器官捐献;静脉注射用免疫球蛋白;人类疱疹病毒[中图分类号]R617，R619.3[文献标志码]A[文章编号]1674-7445（2019）06-0011-06NextgenerationsequencingscreeningforhumanparvovirusB19infectionafterlivertransplantationandtheanalysisofrelatedriskfactorsChenTuo*,LiRuidong,YingYue,TaoYifeng,ShenConghuan,JinYanting,WangZhengxin.*DepartmentofGeneralSurgery,LiverTransplantationCenter,HuashanHospitalAffiliatedtoFudanUniversity,Shanghai200040,ChinaCorrespondingauthor:WangZhengxin,Email:wangzhengxin@huashan.org.cn[Abstract]ObjectiveTosummarizethescreeningmethodsforhumanparvovirus(HPV)B19infectionafterlivertransplantationandanalyzetherelatedriskfactors.MethodsClinicaldataof86recipientswereretrospectivelyanalyzed.Accordingtotheresultsofnextgenerationsequencing(NGS),allrecipientsweredividedintotheHPVB19infectiongroupandcontrolgroup.Clinicalcharacteristics,treatmentregimeandclinicalprognosisofpatientsinfectedwithHPVB19wereanalyzed.TheriskfactorsofHPVB19infectionwereanalyzedusingunivariateandmultivariateLogisticregressionmodelbyforwardLRstepmethod.ResultsNineofthe86recipientsdevelopedfeverandprogressiveanemiawithunexplainedreasonsatapproximately2weeksafterlivertransplantation.NGSdetectiondemonstratedthatHPVB19waspositiveandtheywerediagnosedwithpureredcellaplasia(PRCA)causedbyHPVB19infection.Afterintravenousimmunoglobulins(IVIG)wasgivenandtheimmunosuppressanttherapywasadjusted,thehemoglobinlevelsinallpatientsDOI:10.3969/j.issn.1674-7445.2019.06.011基金项目:国家自然科学基金面上项目（81873874、81773089）;国家重大科技专项（2017ZX10203205）作者单位:200040上海，复旦大学附属华山医院普外科肝移植中心（陈拓、李瑞东、陶一峰、沈丛欢、金嫣婷、王正昕），感染科（应悦）作者简介:陈拓，男，1994年生，硕士研究生，研究方向为肝胆肿瘤与肝移植的基础和临床研究，Email:zjwzct@163.com通信作者:王正昕，男，1968年生，博士，主任医师，博士研究生导师，研究方向为肝胆肿瘤与肝移植的基础和临床研究，Email:wangzhengxin@huashan.org.cn第10卷第6期2019年11月Vol.10No.6Nov.2019器官移植OrganTransplantation陈拓等.肝移植术后人类细小病毒B19感染的二代测序筛查及其相关危险因素分析·697·weresignificantlyincreased.Theresultsofmultivariateanalysisrevealedthatlowserumglobulinlevelinperipheralbloodatpostoperative7d[oddsratio(OR)=0.749,P=0.040]andyoungage(OR=0.937,P=0.038)weretheindependentriskfactorsofHPVB19infectionafterlivertransplantation.ConclusionsHPVB19infectionshouldbeconsideredinrelativelyyoungpatientswithunexplainedhemoglobindeclineearlyafterlivertransplantation.NGSscreeningisaneffectivemethodforearlydiagnosisofHPVB19infection.Lowserumglobulinlevelinperipheralbloodatpostoperative7dandyoungagemaybeindependentriskfactorsoftheincidenceofHPVB19infection.[Keywords]Livertransplantation;HumanparvovirusB19;Pureredcellaplasia;Nextgenerationsequencing;Riskfactor;Infection;Immunerejection;Donationaftercardiacdeath;Intravenousimmunoglobulins;Humanherpesvirus人类细小病毒（humanparvovirus，HPV）B19中男7例，女2例，年龄（39±10）岁。对照组共为一种单链DNA病毒，已有研究表明HPVB19感染可导致移植受者术后纯红细胞再生障碍性贫血（pureredcellaplasia，PRCA）[1-3]。对于免疫功能正常者，HPVB19感染多无表现或症状轻微且具有自限性，而对于免疫功能不全或免疫抑制的感染者，如器官移植受者，临床表现多为发热伴进行性贫血。由于肝移植术后HPVB19检测并未形成常规，所以相关病例报道并不多。近来随着二代测序（nextgenerationsequencing，NGS）检测手段的临床应用[4-5]，复旦大学附属华山医院普外科肝移植中心在对不明原因发77例受者，其中男56例，女21例，年龄（50±11）岁。1.3二代测序检测收集受者外周血标本（均为出现不明原因发热伴进行性贫血后2周内采集），以1000×g离心10min后，提取上层血清，将0.5mL血清置入1.5mL微量离心管中，固定在涡流混合器上的水平平台上，放入玻璃微珠（1g，0.5mm），以800~1200×g离心30min。抽取0.3mL样品使用TIANAmp微量DNA试剂盒（北京天根生物公司）提取DNA。通过对DNA片段化、末端修复、添加A尾、适配体连接和热伴非溶血性贫血进行筛查时发现HPVB19感染是聚合酶链反应（polymerasechainreaction，PCR）扩其主要原因，本文结合以往文献报道，对肝移植术后增这些步骤构建DNA文库，再使用Agilent2100对HPVB19感染的临床特点进行了总结，并探讨其相关DNA文库进行质量控制。通过BGISEQ-100平台对危险因素。1资料与方法1.1一般资料质量合格的文库进行测序。得到的测序结果根据每个属的属特异序列数进行排序。筛选排序前5名的病原体属，并取每个属中排名第1的作为最终结果。1.4治疗方案回顾性分析2018年5月至2019年3月本中心施所有受者术后常规使用他克莫司（tacrolimus，行的86例心脏死亡器官捐献（donationaftercardiacFK506）+甲泼尼龙进行免疫抑制治疗。对确诊为death，DCD）肝移植受者的临床资料。其中男63例，HPVB19感染相关的PRCA患者，其核心治疗方女23例，年龄15~72岁，中位年龄49岁。原发病包案为早期应用静脉注射用免疫球蛋白（intravenous括肝脏恶性肿瘤42例，良性终末期肝病44例。所有患者手术顺利，术后均接受常规抗排斥治疗。1.2筛选标准及分组immunoglobulins，IVIG），同时联合其他辅助治疗，具体方案如下[6]:（1）予以大剂量IVIG冲击治疗，400mg/（kg·d），连续应用5~10d;（2）根据患者纳入标准:（1）术后出现明显贫血表现;（2）实免疫功能，调节免疫抑制剂用量;（3）给予吸氧、验室检查提示外周血血红蛋白水平短期内进行性下降;（3）大便隐血试验阴性;（4）NGS提示输血等对症支持治疗。1.5统计学方法HPVB19DNA阳性。排除标准:（1）存在血液系统疾病者;（2）存在失血者;（3）存在药物影响因素者。根据纳入标准和排除标准将受者分为HPVB19感染组（感染组）和对照组。感染组共9例受者，其采用SPSS20.0软件进行统计学分析。非正态分布的计量资料以中位数（全距）表示，比较采用Mann-WhitneyU秩和检验。计数资料以率表示，比较采用连续校正的χ2检验或Fisher确切概率法。采用Logistic回归向前LR逐步法进行多因素分析。第6期·698·P<0.05为差异有统计学意义。2结果2.1临床特点9例HPVB19感染患者术后2周左右出现不同程度发热、自诉头晕、乏力，贫血貌，无皮疹、关节痛;血红蛋白进行性下降，最低血红蛋白水平为50~86g/L;白细胞、血小板水平接近正常;NGS提示HPVB19DNA阳性，部分患者合并其他感染（表1），实验室检查排除其他贫血诱因，确诊为HPVB19感染相关PRCA。2.2治疗过程及预后Logistic回归向前LR逐步法进行多因素分析表明，术后7d外周血清球蛋白水平[比值比（oddsratio，OR）=0.749，P=0.040]、年龄（OR=0.937，P=0.038）是引起肝移植术后HPVB19感染的独立危险因素。3讨论近年来，随着检测技术的发展，肝移植术后HPVB19感染相关PRCA的报道逐渐增多[7-11]。HPVB19属于细小病毒科红细胞病毒属，由Cossart等[12]首次发现，其与多种疾病的临床表现相关[1-2,13-14]。对于肝移植受者而言，HPVB19感染可能源自以下3种在确诊HPVB19感染以前，9例患者术后均接途径:（1）受者来源，受者处于亚临床感染状态，受FK506+甲泼尼龙免疫抑制治疗，予以输血、补充术后免疫功能降低，HPVB19再燃;（2）供者来源，人促红细胞素和铁剂等对症治疗，难以改善患者贫血捐献者处于HPVB19活跃期;（3）血液和（或）血状态。确诊HPVB19感染后，9例患者均接受IVIG液制品来源。HPVB19因其特殊理化性质，常规方法冲击治疗，并调整免疫抑制方案，患者贫血状态显著改善，血红蛋白水平升高至92~122g/L，均康复出院。2.3感染因素分析经Mann-WhitneyU检验、连续校正的χ2检验及Fisher确切概率法检验，提示两组间年龄、术前胆红素水平、术前凝血酶原时间国际标准化比值不能有效去除，潜在污染的血液及血液制品可能被用于肝移植手术[15]。国内报道的肝移植术后HPVB19感染多发生在术后早期，主要表现为进行性严重贫血伴发热;少数患者可有红斑、皮疹、关节炎等表现[16]。本文9例患者，均在术后2周左右出现血红蛋白进行性下降，（prothrombintimeinternationalnormalizedratio，伴不同程度发热，且对症治疗效果不佳。肝移植术后PT-INR）、终末期肝病模型（modelforend-stageHPVB19感染的确诊主要根据骨髓细胞学检查、血liverdisease，MELD）评分、术后7d外周血清球蛋白水平比较，差异有统计学意义（均为P<0.05，表2），上述因素为肝移植术后HPVB19感染的可能危险因素。清学检查及病毒DNA检测结果（扫描二维码可见国内肝移植术后HPVB19感染相关PRCA的临床诊疗特点）[7-11]。对受者而言，由于免疫功能受抑制，体内特异性抗体减少，血清特异性抗体检测难以有效反表1肝移植术后HPVB19感染患者一般情况Table1GeneralsituationofpatientswithHPVB19infectionafterlivertransplantation例序年龄（岁）性别合并感染情况治疗前血常规治疗后血常规HbWBCPLTHbWBCPLT（g/L）（×109/L）（×109/L）（g/L）（×109/L）（×109/L）123456789394618393835514738男男女男男女男男男HHV5型–HHV5型–HHV6B型–HHV5型–HHV5型5086647185546678777322310829259100811872127018946113921161161201109612111212265569144510207108150253224235221111182–表示无;HHV为人类疱疹病毒;Hb为血红蛋白;WBC为白细胞;PLT为血小板第10卷器官移植陈拓等.肝移植术后人类细小病毒B19感染的二代测序筛查及其相关危险因素分析·699·表2肝移植术后受者HPVB19感染的单因素分析Table2UnivariateanalysisofHPVB19infectioninrecipientsafterlivertransplantation变量性别[n(%)]男女年龄[M(R)，岁]术前消化道出血情况[n(%)]有否术前胆红素水平[M(R)，μmol/L]术前血清肌酐水平[M(R)，μmol/L]术前PT-INR[M(R)]术前PT[M(R)，s]术前淋巴细胞绝对值[M(R)，×109/L]MELD评分[M(R)，分]手术时间[n(%)]≥7h<7h术中出血量[n(%)]≥1L<1L术中输血量[n(%)]≥1.5L<1.5L术后7d外周血清球蛋白水平[M(R)，g/L]住院时间[n(%)]≥30d<30d感染组（n=9）对照组（n=77）7（78）2（22）39（10）1（11）8（89）260（379）63（18）2.1（1.4）22（14）1.3（0.5）25（21）2（22）7（78）7（78）2（22）6（67）3（33）22（3）6（67）3（33）56（73）21（27）50（12）3（4）74（96）31（123）64（24）1.3（0.6）15（8）1.0（0.5）11（13）33（43）44（57）57（74）20（26）35（45）42（55）23（5）34（44）43（56）P值1.000a0.003c0.363b0.041c0.849c0.034c0.061c0.076c0.043c0.404a1.000a0.394a0.006c0.353aa使用连续校正的χ2检验;b使用Fisher确切概率法;c使用Mann-WhitneyU秩和检验;PT为凝血酶原时间映HPVB19感染情况，存在假阴性可能[17]。不同于PCR难以检测未知病原体的缺点[18]，NGS可通过高通量测序，相对全面获取病原体信息，有助于术后不参考意义。本研究发现肝移植受者术后7d外周血清球蛋白水平低和年龄是HPVB19感染的独立危险因素。外明原因发热的早期鉴别，对后续抗感染治疗具有重要周血清球蛋白中包含多种抗体，一定程度上可反映机体免疫状态。有研究报道肝移植术后早期外周血清球蛋白水平降低程度与术中失血量相关[19]，因此术中大量失血可导致免疫球蛋白水平下降。另外，肝移植受者术中及术后应用大剂量糖皮质激素，也可造成免疫球蛋白水平下降[20]。此外，年龄与HPVB19感染风险呈负相关。由于HPVB19普遍易感，随着年龄的增长，机体发生获得性免疫进而产生HPVB19IgG的可能性越大，血清抗体阳性率随年龄增大而累积升高，这与国内外相关文献报道相符[21-22]。因此，对扫描二维码可见国内肝移植术后HPVB19感染相关PRCA的临床诊疗特点第6期·700·于移植术后低外周血清球蛋白血症伴不明原因发热的年轻受者，需警惕HPVB19感染风险。HPVB19感染尚无特效抗病毒药物。近来发现，羟基脲、西多福韦、香豆素衍生物及吡莫西特等药物可体外抑制HPVB19活性或阻碍其扩增，具有潜在治疗价值[23-24]。目前主要治疗措施为大剂量IVIG冲击治疗，可能与IVIG中含有特异性IgG抗体可有效中和病毒有关[25]。常用剂量为400mg/（kg·d），持续5~10d，但最佳用药方案尚无标准，我们推测，其用量应与IVIG中特异性抗体滴度有关。研究显示，93%的PRCA患者对IVIG治疗敏感，但约1/3患者平均4.3个月后出现复发[17]。对于复发患者，仍可采用IVIG治疗。另有文献指出将术后PRCA患者的免疫抑制剂FK506调整为环孢素[26]，可促进机体产生中和抗体，增进治疗效果。本研究中，感染患者仍维持FK506为基础的免疫抑制方案，个体化调整剂量并减少糖皮质激素用量，并均予以400mg/（kg·d）IVIG冲击治疗，持续5~7d，患者血红蛋白水平显著升高（表1）。其中，例6患者术后53d血红蛋白再度下降，低至67g/L，再次予以IVIG治疗5d后，血红蛋白水平升高。综上所述，相对年轻的患者在肝移植术后发生不明原因发热伴血红蛋白持续下降，需警惕HPVB19感染风险，应注意术后维持免疫球蛋白水平。NGS有利于早期筛查HPVB19感染。目前治疗方法仍以大剂量IVIG冲击及个体化免疫治疗为主。早期诊断和及时治疗有助于肝移植术后HPVB19感染患者获得良好预后。参考文献:[4]DEURENBERGRH,BATHOORNE,CHLEBOWICZMA,etal.Applicationofnextgenerationsequencinginclinicalmicrobiologyandinfectionprevention[J].JBiotechnol,2017,243:16-24.DOI:10.1016/j.jbiotec.2016.12.022.[5]PARKERJ,CHENJ.Applicationofnextgenerationsequencingforthedetectionofhumanviralpathogensinclinicalspecimens[J].JClinVirol,2017,86:20-26.DOI:10.1016/j.jcv.2016.11.010.[6]李瑞东,王正昕.肝移植术后免疫抑制剂的个体化用药[J/CD].中华临床医师杂志（电子版）,2013,7(1):5-6.DOI:10.3877/cma.j.issn.1674-0785.2013.01.003.LIRD,WANGZX.ofimmunosuppressantsafterlivertransplantation[J/CD].ChinJClin(ElectrEdit),2013,7(1):5-6.DOI:10.3877/cma.j.issn.1674-0785.2013.01.003.Individualizeduse[7]ORAMASDM,SETTYS,YELDANDIV,etal.AcasereportofparvovirusB19infectioninarenalallograft[J].IntJSurgPathol,2017,25(7):648-651.DOI:10.1177/1066896917712452.[8]ZHANGM,ZHONGX,ZHANGW,etal.HumanparvovirusB19infectioninducedpureredcellaplasiainlivertransplantrecipients[J].IntJClinPractSuppl,2015(183):29-34.DOI:10.1111/ijcp.12664.[9]任庆旗,鞠卫强,王东平,等.肝移植后人细小病毒B19感染导致单纯红细胞再生障碍性贫血一例[J].中华器官移植杂志,2016,37(3):144-149.DOI:10.3760/cma.j.issn.0254-1785.2016.03.004.RENQQ,JUWQ,WANGDP,etal.DiagnosisandtreatmentofpureredcellaplasiacausedbyhumanparvovirusB19afterreportofonecaseandliteraturereview[J].ChinJOrganTransplant,2016,37(3):144-149.DOI:10.3760/cma.j.issn.0254-1785.2016.03.004.transplantation:liver[1]TSCHÖPEC,ELSANHOURYA,SCHLIEKERS,etal.ImmunosuppressionininflammatorycardiomyopathyandparvovirusB19persistence[J].EurJHeartFail,2019,DOI:10.1002/ejhf.1560[Epubaheadofprint].[2]SHINH,PARKS,LEEGW,etal.ParvovirusB19infectionpresentingwithneutropeniaandthrombocytopenia:threecasereports[J].Medicine(Baltimore),2019,98(35):e16993.DOI:10.1097/MD.0000000000016993.[3]EIDAJ,ARDURAMI,ASTInfectiousDiseasesCommunityofPractice.HumanparvovirusB19insolidorgantransplantation:guidelinesfromtheAmericanSocietyofTransplantationInfectiousDiseasesCommunityofPractice[J].ClinTransplant,2019,33(9):e135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