表面活性剂协同超声波酶法提取三七花总皂苷工艺优化及抗氧化活性研究
【摘要】 建立并优化了表面活性剂协同超声波酶法提取三七花总皂苷的工艺条件。以TritonX-100表面活性剂为提取溶剂，在复合酶添加量为0.2%(质量分数），液固比为30:1(m!g)，TritonX-100溶液pH值为5时，表面活性剂协同超声波酶法提取三七花总皂苷最优条件为:酶解温度60O，超声功率465W，超声40min，此时三七花总皂苷的提取率为16.38%，高于传统的回流加热提取、超声波辅助提取。对3种工艺提取三七花总皂苷进行抗氧化活性测定，结果表明，表面活性剂协同超声波酶法提取得到的三七总皂苷对1，1-二苯基-2-E硝基苯肼(1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)自由基清除能力更高，总抗氧化能力更强，其质量浓度为0.156mg/mL时，对DNA损伤保护作用最强。该研究方法萃取效率较高，环保安全，易于推广应用。关键词表面活性剂;超声波;酶解;三七花;总皂苷Enzymolysis-ultrasound-assistedsurf^ct^ntextractionandantioxidantacti'vit^ofsaponinsfromPanaxnotoginsengflowersCHENHonghui12，TARUNBELWAL2，LIGangfeng2，LUOZisheng234!1(CollegeofChemistryandEngineering，WenshanUniversity，Wenshan663099，China)2(CollegeofBiosystemsEngineeringandFoodScience，ZhejiangUniversity，Hangzhou310058，China)3(FuliInstituteofFoodScience，ZhejiangUniversity，Hangzhou310058，China)4(KeyLaboratoryofAgro-l^roductsPostharvvstHandling，Ministry〇fAgricultureandRuralAffairs，ChinaNational-LocalJointEngineeringLaboratory〇fIntelligentFoodTechnologyandEquipment，ZhejiangKeyLaboratorforAgro-F^oodProcessing，ZhejiangEngineeringLaboratory〇fFoodTechnologyandEquipment，ZhejiangUniversity，Hangzhou310058，China)ABSTRACTAnenzymolysis-ultrasound-assistedsurfactantextractionmetliodwasdevelopedandoptimizedtoenhancethesaponinsyieldfromPanaxnotgisngflowers.TheTritonX-100surfactantwasusedasextractionsolvent.Whentheenzymeconcentrationwas0.2%，solventtosampleratioat30:1(mL:g)andTritonX-100solutionatpH5，theoptimalextractionconditionofenzymolysis-ultrasound-asistedsurfactantextractionwasasfollows:Enzymolysistemperatureat60Oandultrasonicationpowerwas465Wfor40min.Undertheoptimizedcondition，theyieldoftotalsaponinwas16.38%，whichissignificantlyhigherthanthatoftraditionalheatrefluxextractionandultrasound-assistedextractionmetiiods.Inaddition，theantioxidantactivityofPanaxnotgisngsaponinsextractedbythreeprocessesshowedthatthePanaxnotoginsengsaponinsextractedbyenzymolysis-ultrasound-assistedsurfactantextractionmetiiodabilityofDPPHfreehigherscavenginghadradicalsandstrongertotaltioxidantcapacity.IncaseofprotectingactivityagainstDNAdamage，0.156mg/mLofsaponinswasoptimum.Ourfindingclearlydemonstratedthatthedevelopednovelenzymolysis-ultrasound-assisted第一作者:硕士，副教授（罗自生教授为通讯作者，E-mail:luozisheng@zju.edu.cn)基金项目:浙江省重点研发项目（2020C02040);云南省教收稿日期:2020-06-23，改回日期:2020-07-21项目（2019J0908)1782020Vol.46No.20(Total416)surfactantextractionmetliodcouldbeappliedtogainhigherextraction3ficiencyofsaponins,developedmetliodisenvironmentallysafeandeasytobescaledup.Keywordssurfactant&ultrasonication&enzymolysis&flower;totalsaponin生产与科研应用三七为中国特有的名贵中药材，又称“田七”、现出一定优越性&超声辅助萃取通过提供超声波，产“金不换”，主要产于云南省文山州。除含有三生空化气泡，胞损伤，在七皂甙外，还有发油、氨基酸等多种活性成分，三七放大中均证明了其较高的效率[17.18]。结合对于心血管和脑血管系统具有生理活性作用，抑这些提取技术的优点，建立了一种新的酶法-肿瘤细胞的生长，免疫系统系统，并具超声辅助表面活性剂方法，考察其有抗抗衰老的特性[1<。全中含量的效，并法超辅助法最高，种类与根茎部位有所差异，发现三统。降血压，降血脂的功效优于[0)。如今，有500家、化妆品公用:作1材料与方法为原料，三七产发展具有巨大的市场前景，但目前1.1材料与试剂国内系列产品为原料加工而成，三七，产于云南文山&标准品人参皂苷Re、通常作为泡饮或作为菜食用，其利Rgi、Rc、、Rb2、Rb3、Rd、F2，三七患昔R、Fc、Fe，用济附加值都，的深人开发是三产业发展的趋势。北京中科益友化工院&1，1-二苯基-2-三基:(1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)(纯度>于中草药产品的开发，安全高效是成分提取的986)、Trit〇nX三00、Fe-三吡啶三吖嗪（TPTZ)、纤维重要前提。常见的提取方法中、煮沸、渗滤等方素酶、果胶酶等，上海Aladdm公，均为分析纯&式通常需要大量的溶剂和时间，成，存在(puc19DYA质粒，生工生物工程（上海）有限效、环境污染[7]。另外，以上统方公。法会导，导物的生物活性降低[>]。1.2仪器与设备来，各种新的方法应用于中效成分的提KQ-00E超声波清洗器，昆山市超声仪器有限取，双相萃取，离子液提取，超[9-18]，公司&GeminiSEM300热场发射扫描电子显微镜，德些方法成本高，容成环境污染，难国CalZeiss公司&DYCZ三4DY电泳仪，浙江纳德科。目前，的最新趋势要集中在寻找仪器有限公司&凝胶成像分析系统，北京德科尽量减少污染，降低提取溶剂消耗和能量要求。近技发展有限公司&酶标仪，瑞士TECAN公司。来，应用表面活性剂统的有机溶剂产1.3的物分离成为研究新方向[1N]，由于它本身具有两将生的新通过冷冻干燥机干燥后，亲性，它可以同时极性范围跨度很大的目标化合物[20]。VIEIRA等[21]利用非表面活性剂从微藻用粉，通过40目筛。粉末被收集在的瓶，储在-200的供进的中了类胡萝卜素，马[22]采用超声-表面活性一步分析。粉进行了不同剂同的方法中的，效。。采用表面活性剂他方法相比具有1.3.1加热回流提取（heatrefluxextraction,HRE)、、安全性高、成点，可产业化称取1.00g三七花粉，加人含有30mL体积分生产[2)]。数为706的的圆底烧瓶中，将三七花粉，醇采用传统方法对三七花皂苷的提取已有大量研，而，、效的方法少，均合，然后置于水浴锅中，下回流加热1.5h。连接，在700表面活性剂作为溶剂已经被证明具有良好的效1.3.2超声辅助提取（ultrasound-assistedextraction，率，但要步效率，还需要开发一种联合UAE)方法。酶胶酶等在破坏细胞壁、提高将1.00g三七花粉放人锥形瓶中，加人30mL生物活性成分的步缩短提取时间方面表706(体积分数）的乙醇，旋涡搅拌后，在60O温度，2020年第46卷第20期（总第416期)179食品与发酵工业FOODANDFERMENTATIONINDUSTRIES超声功率465W的超声波清洗器中提取40mm。应，验证响应实验的有效性。1.3.3酶解超声辅助表面活性剂提取（6似7111〇8313-ultrasound-assistedsurfactantextraction,EUASE)将三七花粉（1.00g)与30mLTritonX-100溶液(0.24mm〇l/L)和0.2%复合酶[>(纤维素酶）:>(果胶酶）=4:6]在50mLPFTE容器中混合均勻，将容器盖上，在60O下恒温水浴酶解孵育1.5h,然后将反应化合物置于超声波处理40min。1.4三七总皂苷含量测定方法中以465W超声采用香草醛-高氯酸法测(Pa-naxnotoginsengsaponins，PNS)含量[15]，以三七患苷R,为对照，线性回归方程为:G=2.4283j-0.0024,B2=0.9997,其中g为吸光值，x为皂苷含量（mg)，根据回归方程可计PNS得率:PNSW*，=Z!(1)>1.5实验设计1.5.1单因素实验30iL13iL133y;=1_/=-1r=$0+y$...+y$.2+y(2)式中:K为响应因变量（PNS)，$是回归常数;$+第-欠线性系数;$+第-欠二次项系数;是第-项系数G&y);n是实验中化的因子数量，.和.是编码的独立变量[13,25]。1.6抗氧化:1.6.1PNS对DPPH自由基清除能力测定将EUASE化下的PNS液稀释成不同浓度，参考HUANG等[26]方法，并少量修改，测定PNS对DPPH自由基的活性清除。准确吸取各浓度提取液100"L转移至96孔板，然后将190"LDPPH溶液（0.1mm〇l/L)添加到各样品中，在暗中反应0.5h，测定515nm处吸光值，甲醇作为空白对照，结果表达为毫克Trlox当量每克干物质（mgTE/gDW)。1.6.2铁离子还原/抗氧化能力（Ferricmnreduct-ing/antioxidantpower，FRAP)实验测定PNS抗氧化力在单因前，进行了预实验以选择最佳溶参考HUANG等[26]方法进行适当修改。按照体方法，在预剂十二烷基苯磺酸钠、十二烷基硫酸钠、曲通X高00、中测试不同溶剂（水、*积比例10份醋酸缓冲液（0.1m〇l/L)，1份TPTZ(10mmol/L)，1份FeC/(20mmol/L)混合配制FRAP试吐温20)中，溶剂曲拉通X-100酶解超声法提取方法（水浴、超波、酶解超声波）剂。取样品提取液100"L，加人FRAP190"L，混合均勻，置于37O水浴锅中10mi，然后于593nm下最高[24]。通过单因素试因素的最佳条吸测定，为空白。表达为毫件。分别设定复合酶添加量（0.04%~0.24%，质量克Trolox当量（TE)每克干物质（mgTE/gDW)。分数）、酶解pH(2~7)、酶（20~70O)、酶孵1.6.3PNS对质粒DNA氧化损伤的保护作用育时间（0.5~3h)、液固比（10:1~60:1)、超声功率通过加人不同浓度样品溶液，DNA氧(300~600W)、超声时间（10~60min)和超声温度化损伤变化影响。分别移取pUC18质粒DNA1"L，(30~80O)在不同下提取。因了PNS提取液4"L，Fenton氧化剂（100"mo/L的Fe-6个层次的测试，每次改变1个因，其他因素SO4、1mmol/L的H2O2和104"mol/L的EDTA)不变。8"L，用PBS补体积均为20"L于2.0mL离心管1.5.2响应面优化三七花总皂苷提取条件中。离心振荡后置于37O浴锅中60mi，加人通过因分，选择2.0"L10XLoadingbuffer染色，混勻，经琼脂凝胶电有显著影响的3个因（超时间、酶、超泳分离25mi，使用凝胶成像分析系统照相[27]。功率）进行Box-ehnken(BBD)设计，自变量分别为1.7HPLC测定皂苷组分.(超声时间），.（酶PNS提取率为实验的响应值K，通过试验进行分析。），.（超），以用高效液相色谱（Waterse2695)配合2998PDA检测器测中组分，检测波长为203nm。将数归分析并拟合到二阶多项式模型，如公式（2)所示。为了推导出二次方程，使用BBD设EUASE患苷提取液用0.22"m滤膜进行过滤，用Agi-lent:8柱（4.6mmX250mm，5mm)分离，流动相溶剂计了17阶乘点和5个中心点的，统计分析A(乙腈）和溶剂B(0.5%磷酸）梯脱:0〜5mi，BBD中的数据，建立数学模型，估计独立变量的响25%A;5〜20min，30%A;20〜30min，35%A;30〜701802020VqI.46No.20(Total416)生产与科研应用min，456A;70〜80min，356A&80〜90min，256A。2.2单因素实验分析注人10"L样品体积，在柱温40O，0.32.2.1超声时间对PNS提取率的影响mL/min下洗脱分离。1.8扫描电子显微镜观察米用扫描电子显微镜（scanningelectronmicro-scope，SEM)前后的样品进行观超声时间在10~60min与PNS提取率的关系如图1-A所示。当超声开始时，PNS提取率相对较低，但是20mi后，PNS的，并在50min时提取率最高，这是由于在超声过程中，在声波察。分1g干燥三七花粉末，进行HRE、UAE、振动影响下，介质细胞受到不同程度破坏，此外机械EUASE养皿内，在60O风，然后过滤提取液，收集滤渣置于玻璃培1h。用导电胶将中后的样品粘在样品台上并喷金，在电压为5.00k'，高真空条件下，使用SEM进行观察。1.9数据分析与图形绘制有均了3次不行，结果以均值±标准差表东;BBD设计采用DesignExpert(Version10.0)&统计用ANOVA采用SPSS17.0Duncan差异分析，差异的性被，组间差异采定义在56的水平（）<0.05);实验结果图用Ongm8.0绘制。2结果与分析能转变为，使得介质，加速分而促进有效成分的溶解[11]。见，需要达，从超声时间对物料才可产生明显的空化效应和机械效应，从而提高PNS的提取率。当超声时间大于50mi，PNS的减少，是烈的效应会破坏皂苷化合物的苷元，溶的PNS产物部分被分解，从而导致下降，这种现象在其他成分有类似影响[25]。2.2.2酶解温度对PNS提取率的影响由于酶属于生物活性物质，酶溶液反应温度严重影响酶的活性和构象。酶解温度在20~50O范围内与PNS提取率的关系如图1-B所示。在50O以下时，随温度增加PNS的提取率升高明显，提取率最高达2.1单因素实验多重比较分析15.656，现象的原因是酶需要在最适的下激为优化工艺，对各单因素的最佳提取率发其活性，植物组织才有效分解，有效成分也因分析，影响PNSI此溶出。超过50°C，PNS的现的因素，为BBD设计提供判断依据，多下降，是于超过是会导酶性降。表1。表1不同因素对PNS提取率影响的多重比较Table1MultiplecomparisonsoftheeffectsofdifferentfactorsontheyieldofPNS因最佳•复合酶添加量0.6(质量分数）酶解pH5酶解温度50C酶解时间1.5h液固比30:1(mL:g)超声功率420W超声时间50min超70C均值/%5616极15.03±0.2313.31±0.4915.65±0.013.33±0.3214.45±0.1015.89±0.615.83±0.1415.07±0.20dadcaaTBCDABDCAABC注:不同字母表示具有显著性差异（）<0.05)通过对各单因素的多重比较分析，不同因素中超声时间、酶超PNS的他因差异（）<0.05)，余因，他因相比，具有性2.2.3超声功率对PNS提取率的影响由于空化效应，超声功率在过程中发挥了重要作用。超声功率在300~600W范围内与提取率的关系如图1-C所示。当超声功率为420W时，PNS提取率最高，达到15.896，功率继续增加反而降低了PNS的。通过超声波的频，改变空穴，达的目的。需引起注意的是，超声频率过高相反引下降，这主要是超声波产生的辐胞组织变形，植物蛋白质变性，对有效成分2"Box-Behnken设计优化变量坏或分解[25]。2.3.1模型建立与统计分析利用软件DesignExpert(Version10.0)进彳了实验设计和数据分析。解温度、超声功率）对响应值（PNS提取率）的影响，BBD实验设计及PNS提取率见表2,通过多元回归分了3个随机因子（超时间、酶PNS影响不显析，得到PNS提取率的多元二次回归响应面模型如下:，故实验选择超声时间、酶、超为主要K&15.12t0.070.t0.11.2t0.15.3-0.13.12t影响因素，进行响应面优化实验。0.070.13+0.28.23+0.24.+0.56.+0■14.2020年第46卷第20期（总第416期)181食品与发酵工业FOODANDFERMENTATIONINDUSTRIESnBa•j10i20&M>i10iSOkUOTO超声时间/mm15i涔i'0,Z------------1-------------1-------------1------------\802040<»0ck>「15錄u.12240.mMA)120WU)MO超茚功•率AVr^MIA-超声时间;B-酶&C-超f率图1单因素对PNS提取率的影响Fig.1EfectofsinglefactorontheyieldfromPNS注:不同字母表示具有显著性差异（）<-.05)表2Box-Behnken实验设计及响应值结果Table2ResultsofBox-Behnkendesigntests试验号超时间⑷/min酶(6)/O超(C)/W-1(360)0(420)0(420)0(420)1(480)0(420)1(60)0(50)0(50)0(50)0(50)1(60)-1(40)-1(360)0(50)0(50)1(60)0(50)1(60)-1(40)-1(40)0(50)1(60)0(420)1(480)1(480)0(420)0(420)0(420)1(480)-1(360)-1(360)得率/%15.4815.0815.1315.1515.4716.1715.8815.0615.8516.3215.1715.9615.6315.615.415.30(50)0(50)0(50)0(50)-1(40)-1(40)0(50)0(50)1(60)0(50)0(50)1(60)-1(40)0(50)1(60)-1(40)1(60)-1(40)0(420)15.921234567891011121314151617通过*统计量、响应面的二次多项式模型的方差分析（ANOVA)检了回归模型的性，表3给出了型项的回归系数值。BBD模型表现为极显()<0.0001)，*统计量为51.49,表明该模型极，具有统计学意义;失拟项0.092不，说明该模型拟合程想，可用于PNS皂苷优化。模型中得到的确定系数B2#0.9851，表明98.516的变化可以用拟合模型解释，调整后的确定系数BAd为0.9660,说明模型拟合，实验值预测值非常接近，的变异系数（C.V.=0.476)表明值的性性。因素的对PNS提取率影响排序为:超声功率>酶解>超声时间。可见，超波作用的PNS影响最大。超声波作用下化合物的降，理包括异构化、水解反应和热效应，也可以认为超声波的增加会产生大的气泡，会影响超声波在介质中的传播(27)。在二次项中，..对PNS提取率表现出极显著的影响（）<0.01)，.2对PNS提有的线性影响（）<0.05)。表3回归方差分析表Table3Analysisofvarianceoftheregressionmodel*值)值性51.49<0.0001!!项目模型.2.3.3.22.23差失拟纯误差总和方2.490.0390.100.170.0630.020.310.251.310.0870.0380.0298.68E-03自由度9111111111734均方0.280.0390.100.170.0630.020.310.257.3018.8632.4211.643.6558.4146.50.03050.0034!!0.0007!!0.0113!0.09770.00010.0002!!!!!!!1.31244.64<0.000116.150.0875.37E-039.63E-034.442.17E-030.00510(0922.53B2二0.9851B2Adj二0.966016C.V.6=0(47注-表示显著（）<0.05)，“-表示极显著（）<0.01)2.3.2响应面交互影响通过绘制三维响应面图及等高图，可以直观的反映各因素与PNS提取率的相互影响关系。由图2-A看出，与酶方向，超曲线更陡峭。当酶大于550时，线密度非常密集由表3可看出，回归方程的一次项中，超声功率(图2-B)，表明酶超声功率（.3)存在显(.，）<0.01)对PNS提取率差异极显著，酶解温度用。在2-C2-D中，酶(.)和超声时间（.）对PNS提取率影响为显著，各超声时间的响应曲面较陡，等高线趋向椭圆形，说明1822020Vol.46No.20(Total416)生产与科研应用此时超声时间和酶间的用对PNS提值的符合度较高，证实了响应模型预测的适用性，该的有较大影响。适宜的酶于溶剂[用步用于从中PNS。深人进人组织内部，一定的超声时间为原料产生疏松2.4EUASE和其他传统方法的比较形成重要影响，二者之间有的影响分别采用HRE、UAE和EUASE三种方法对三七系。这种相互影响关系在、苦活性物质提取的超声波酶法论[11.13)。由图2-E和图2-F可看出，响应曲面较中也有相同结花进行PNS提取，由图3可知，HRE提取效率最低，为(13.47±0.12)6，UAE提取效果优于HRE提取，达到(15.63±0.08)6，2种方法相同之处在于提取溶剂，线密度均匀，无密集情况出现，表明超均为乙醇，但UAE的效率归因于超声超声时间的用不。产生的空穴效应，对原料细胞壁坏，导致固液相的接触面积变大，有效成分溶出。以上中EUASE法得到最高的提取率，为（16.38±0.02)6，比HRE高约2.91%，比UAE提高了0.75%，原因是主要由于处于临界浓度的表面活性剂胶束更容易渗透进人细胞，具有更好溶解提取物的能力，可见，表面活性剂有机溶剂后，通过超声酶解辅助作用，提取物溶出量更多，。有报道采用发酵法辅助，利用微生物产生的酶破坏三七细胞壁结构，可提取含量达到（12.25±0.21)6，比醇提含量（9.05±0.43)6了35.366[28]，虽有较大提高，但发酵时间需4d，效率低。LIN等采用离子液体超声提取从人参根中人参[29)。在优化条件下总皂苷提取率达（17.81±0.47)mg/g;WANG[15)采用微波辅助酶解法对人参茎叶取，最佳条件下提取含量为（60.62±0.85)#///。与现有的的相，EUASE法具有效，溶剂安全，成，可工化势，表明，该方法简便、高效、低成本、环保，他植物有效成分的有参考价值。2.5化活性2.5.1三七总皂苷对DPPH自由基清除效果的测定酚羟基是物质中主要活性基团，自由基能被酚羟基捕获生成稳定的式，使基链式反应终止[30)。采用DPPH法测定UAE、EU-ASE、HRE三种处理方式下及不同浓度PNS的体外抗图2各因素交互作用的响应面和等高线图Fig.2ResjDonsesurfaceandcontourdiagramoftheinteractionofvariousfactors2.3.3模型结果验证以Box-BehnkenDesign#BBD)模型为基础，结合氧化能力，如图3-A所示，各提取物浓度增加时PNS各因素的线性、二次项了EUASE最佳提取条件为:酶解温度59.91O，超声时用的性，间40.21min，超声功率464.69W，通过模型方程预测PNS的最大响应值为16.41%。根据实际实验条件，将最佳条件修改为酶解温度60O，超声时间40mi，超声功率465W，在此条件下进行3次验证实的抗氧化随加，但不同方法的三液抗氧化活性不同，EUASE法的PNS表现明于HREUAE的抗氧化，PNS质量浓度增加到20mg/mL时，EUASE法的样品DPPH自由基清除能力达高150.46mgTE/gDW，而HRE法的样品抗氧化最低，其DPPH基清除能验，PNS提取率平均可达（16.38±0.02)6，与预测力为63.39mgTE/gDW。这是由于酚羟基数目的多少2020年第46卷第20期（总第416期）183食品与发酵工业FOODANDFERMENTATIONINDUSTRIES影响三七皂苷抗氧化能力的差异，当三七花提取浓度增电泳检测质粒DNA超螺的转变，并氧化加，皂苷含量高，故具有较多的酚羟基基团提供氢离子，损护程度。电4中8ne2为DNA损伤未保护表现良好的清除基的作用。由以上ASE法的PNS提取率最高，抗氧化能力最强，HRE法中知，EU-组，该组DNA发生完全氧化损伤，超螺被坏，超螺旋结构数量道1空白组大大减少。在提取时间较长，也会带来元的分解，泳道3~11加人不同浓度PNS对DNA进行孵育，在导致酚羟基数目减少，表现出弱的抗氧化性[26'28]。2.5.2FRAP测定0.0195~0.156mg/mL时，超螺旋结构的质粒DNA明显增多，与浓度呈依赖关系;而在0.156~5.00mg/mLFRAP抗氧化能力测定，即通过待测物质对铁还时，质DNA，表明PNS氧化损原能力，反映样品总抗氧化，抗氧化则吸光值。图3-B中不同方法的PNS样品抗氧化随浓加出现明加趋势，与传统方法（UAE、HRE)相比，以EUASE法物的抗氧化能护作用开始减弱。PNS体外抗氧化，体外抗氧化实验中PNS的清除自由基能力与浓度呈正相关量效关系，而对DNA的氧化损伤保护实验结果中，PNS在低浓度时表现出保护DNA免被氧化损伤的作力增加趋势更明显，最高达264.72mgTE/gDW(20mg/mL)，在相同浓度条件下，3种提取方法PNS提取物的抗氧化能力依次为EUASE>UAE>HRE，故EU-用，在浓度时却有促氧化的作用，原因是中的酚羟基对•OH直接清除，从分子结构来看，•OH可与皂苷分子形成多种消，避免DNA生ASE提取的PNS总抗氧化能力高于相同下USEHRE法的PNS。物分子的损伤，另外PNS式与DNA结合起到保护作用[27]。有合、嵌人等其他方!bitM>ltil.,ttilftittrl泳道1-未损伤DNA;泳道2~11-DNA+Fenton试剂+PNS提取液(0、0.0195、0.039、0.078、0.156、0.312、0.625、1.25、2.50、5.00mg/mL)图4不同浓度PNS提取液对质粒DNA损伤影响的电泳图Fig.4Protectionagainstoxidativedamagetopuc19DNAwitlithediferentconcentrationsofPNSextract2.6HPLC组分分析依次将11种人参皂苷、三七皂苷标准品的混标样品和EUASE法最优条件下提取的样品按1.7方法HPLC分，HPLC5。A-DPPH基清除力;B-FRAP测定5-A中11种标准品的分离保留时间，可看出图5-B图3不同质量浓度PNS的抗氧化活性中三七花通过EUASE法后分离得到三七皂苷Fig.3AntioxidantactivityoftheextractsofPNSatRl、Fc、Fe，人参皂苷Rgl、Rbl、Rb2、Rb3、Rc、F29种皂differentconcentrations组分。2.5.3三七总皂苷对质粒DNA氧化损伤的防护2.7扫描电镜观察结果作用为步了解不同提取方法对三七花皂苷提取生物体衰老和许多疾病的产生据研究表明均与率产生较大差异的原因，使用扫描电下方性氧的参与有密切关系[31]，表明PNS能够有法后的样品，见6。未效清除•OH及0$_•，通过清除捕捉自由基，•OH的氧化作用被螯合体系中Fe2+、Cu2+等元断，DNA被.OH氧化损伤的作用有效保护[31_32]。实验将质粒DNA经Fenton试剂后，通过凝胶样品细胞壁行HRE处理后，样品表面出现疏松结构，有少数部位密，均（图6-A);样品进穿孔，胞壁大部分，没有被破坏，原因可是采用溶剂加热法物料影响不大，导致1842020Vol.46No.20(Total416)能溶出的提取物有限（图6-B);当样品进行UAE处合酶的分解作用下，表面的组织细胞壁分解，再加上理，样品表面结构出现较大空穴HRE法处理，说明超声波的破坏作用比HRE有效得，破坏程度强于超声波产生化气泡，相碰撞过程中，产生更的，植物细胞内部带来更大破生产与科研应用多，穴效应明显，物料疏松，有有效成分与溶剂接触并溶出，从形成的空穴看，内部仍有致密在（图6-C);通过EUASE后，样品结构产生的空穴更大更多，相比较UAE法结构更疏坏，将细胞分解成溶剂中的转移（图6-D)。由上知，不同的处理方小碎片，促使物质的溶在式与样品破坏程度越大提取率也越高。EUASE法处理的原料的破坏程度有直接关系，原料内部结构松，部内部坏人，这主要是由于在复坏性最强，表现出最的是的。A-混标色谱图;B-样品色谱图图5三七花总皂苷色谱图Fig.5ChromatogramoftotalsaponinsofPanaxnotoginsengflowers3结论(1)波酶法通过响应面分析法得到表面活性剂协同超声的最佳工艺为添加0.2%(质量分数）复合酶，液固比为30:1(m!g)的TrtonX-100,在酶解pH为5,酶解温度60o，超声功率465W条件下超声提取40min，PNS提取率可达16.38%。EUASE对PYS提取起到重要作用，与传统A-未处理干燥三七花;B-HRE法处理三七花;C-UAE法处理三七花;D-EUASE法处理三七花图6扫描电镜图像提取方法相比，EUASE法能提高PNS的于保护DNA氧化损伤作用。的表现抗氧化。对I和(2)EUASE法是一种绿色的提取技术，提取溶剂Fig.6Scanningelectronmicroscopeimages采用表面活性剂，具有效、用量少、成*无毒可降解、点。用于在其他植物化学成分;并在优化条件下，用三七花有重要价值的皂苷，应用于各种食品、医药2020年第46卷第20期（总第416期）185食品与发酵工业FOODANDFERMENTATIONINDUSTRIES产品、化妆品中`参考文献[1]MAL，LIUF，FENGZ，etal.Comparativestudyonchemicalcomponentsandanti-inflammat〇GeffectsofPanaxnotoginsengflowerextractedbywaterandmethanol[J].JournalofSeparationScience，2017，40(24%:4730-4739.[2]LIAOPeiran，LIUYing，ZHAOMingzhuo，etal.ThedevelopmentofaPanaxnotoginsengmedicinalli«quorprocessingtechnologyusingtheresponsesurfacemethodandastudyofitsantioxidantactivityanditseffectsonmousemelanomaB16cells[J].Food&Function，2017，8(11%:4251-4264.[3]FENGS，CHENGH，XUZ，etal.Antioxi
