Beclin-1、P62、LC3B在肺炎链球菌感染小鼠肺部中的表达变化
【摘要】 目的:探讨自噬相关蛋白Beclin-1、P62及微管相关蛋白轻链3B（microtubule-associatedproteinlightchain3B，LC3B）在肺炎链球菌感染小鼠肺部中的表达及意义。方法:生长至对数生长期的肺炎链球菌标准株D39用无菌PBS调节浓度为1.5×109CFU/mL，采用鼻滴的方法对50只SPF级雌性Balb/c鼠（6~8周，16~20g）进行处理，分别在感染后0、6、12、24、48h收集Balb/c小鼠支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolarlavagefluid，BALF）及肺组织，瑞氏-吉姆萨染色进行BALF细胞计数，HE染色观察肺组织病理学改变，Westernblot检测自噬相关蛋白Beclin-1、P62、LC3B在肺组织中的表达水平，免疫荧光观察LC3B在肺组织中的表达情况。结果:HE染色显示，小鼠鼻饲肺炎链球菌后12h及24h后肺组织内出现大量炎症细胞浸润。BALF中总细胞数量及中性粒细胞数量于感染后6h开始增高[（1.280±0.506）vs.（6.272±1.312），P=0.000;（0.000±0.000）vs.（3.456±1.308），P=0.000]，在12h时达到高峰[（1.280±0.506）vs.（19.456±0.997），P=0.000;（0.000±0.000）vs.（15.040±1.012），P=0.000]，48h后基本恢复正常水平[（1.280±0.506）vs.（3.520±0.933），P=0.005;（0.000±0.000）vs.（0.128±0.175），P=0.835]。Westernblot结果显示:自噬相关蛋白Beclin-1于感染后6h开始增加[（0.626±0.078）vs.（0.921±0.093），P=0.002]，48h时达到最高水平[（0.626±0.078）vs.（1.884±0.158），P=0.000];自噬相关蛋白P62于感染后6h开始减少[（2.915±0.094）vs.（2.275±0.269），P=0.000]，48h时降低至最低水平[（2.915±0.094）vs.（1.178±0.142），P=0.000];自噬相关蛋白LC3B于感染后12h开始升高[（0.747±0.197）vs.（1.429±0.318），P=0.006]，24h时达到高峰[（0.747±0.197）vs.（2.002±0.451），P=0.000]，48h后降低[（0.747±0.197）vs.（1.563±0.501），P=0.002]。免疫荧光显示:小鼠感染后12h与24h，肺组织中LC3B蛋白表达水平增加。结论:肺炎链球菌感染小鼠肺部后激活自噬的发生，且自噬在免疫调节过程中发挥着重要作用。[关键词]自噬;肺炎链球菌肺炎;Beclin-1;P62;微管相关蛋白轻链3B[中图分类号]R563.1[文献标志码]A[收稿日期]2019-02-27ChangesintheexpressionofBeclin-1,P62，andLC3BinthelungsofmiceinfectedwithStreptococcuspneumoniaeChenXiaoli，XingYu，LiaoLichao，ZhangWenfang，ZhangZhibo，DengShixiong（LaboratoryofForensicMedicineandBiomedicalInformation，TeachingandResearchSectionofForensicMedicine，CollegeofBasicMedicine，ChongqingMedicalUniversity）[Abstract]Objective:Toinvestigatetheexpressionofautophagy-relatedproteins，Beclin-1，P62，andmicrotubule-associatedproteinlightchain3B（LC3B），inthelungsofmiceinfectedwithStreptococcuspneumoniae.Methods:AstandardstrainofStreptococcuspneumoniae（D39）inthelogarithmicgrowthphasewasadjustedtoaconcentrationof1.5×109CFU/mLbysterilizedphosphate-bufferedsaline;thentheresultingsolutionwasadministeredto50specificpathogen-freefemaleBalb/cmiceaged6-8weeksandwithaweightof16-20gbyintranasalinstillation.Thebronchoalveolarlavagefluid（BALF）andlungtissuesoftheBalb/cmicewerecol-lectedat0h，6h，12h，24h，and48hafterinfection.CellsintheBALFwerecountedafterWright-Giemsastaining;pathologicalchangesinthelungtissueswereevaluatedafterhematoxylin-eosin（HE）staining.WesternblotwasusedtodeterminetheexpressionlevelsofautophagyrelatedproteinsBeclin-1，P62，andLC3Binthelungtissues.ImmunofluorescenceassaywasemployedtoobservetheexpressionofLC3Binthelungtissues.Results:HEstainingshowedmassiveinflammatorycellinfiltrationinthelungtissuesofthemiceat12hand24hafterintranasalinstillationofStreptococcuspneumoniae.ThetotalcellcountandneutrophilcountintheBALFincreasedsignificantlyat6hafterinfection作者介绍:陈晓丽，Email:chenxiaoli1992@163.com，研究方向:法医病理学。通信作者:邓世雄，Email:dengshixiong1963@163.com。优先出版:http://kns.cnki.net/kcms/detail/50.1046.R.20190402.0900.004.html（2019-04-03）基础研究DOI:10.13406/j.cnki.cyxb.002046746--重庆医科大学学报2019年第44卷第6期（JournalofChongqingMedicalUniversity2019.Vol.44No.6）肺炎链球菌是社区获得性肺炎的常见致病菌，可适应人体环境并寄宿于健康人体的上呼吸道[1]。肺炎链球菌易侵袭婴幼儿、老年人及免疫功能缺陷者，引起细菌性肺炎、菌血症、脑膜炎等相关疾病[2]。肺炎链球菌所致疾病是儿童死亡的主要原因，在儿童死因中占11%，全球每年约80万小于5岁的儿童死于肺炎链球菌所致感染[3]。肺炎链球菌疾病是宿主与细菌相互作用的结果，最终导致细胞和组织损伤，甚至宿主死亡[4]。自噬是细胞利用溶酶体降解自身受损细胞器及蛋白质，并维持细胞内环境稳定的过程，被分为巨自噬、微自噬和分子伴侣介导的自噬[5]。自噬在应激反应、神经退行性疾病、癌症、衰老及炎症中发挥着一定的作用[6]。研究显示，肺炎链球菌感染细胞模型中存在细胞自噬现象，其具体机制尚不完全清楚[7]。本研究采用鼻饲D39肺炎链球菌建立小鼠肺炎链球菌肺部感染模型，探讨自噬相关蛋白Beclin-1、P62和微管相关蛋白轻链3B（microtubule-associatedproteinlightchain3B，LC3B）是否参与肺炎链球菌感染小鼠肺部过程，以进一步阐释肺炎链球菌肺炎过程中自噬的调控机制，为肺炎链球菌肺炎的防治提供可靠的实验依据。1材料与方法1.1菌株肺炎链球菌标准株D39由重庆医科大学医学检验、临床检验诊断学教育部重点实验室惠赠。肺炎链球菌标准株D39于TSB液体培养基37℃、5%CO2恒温环境中生长至对数生长期，3500r/min离心10min，无菌PBS洗涤2次，调节菌液浓度至1.5×109CFU/mL。1.2实验动物重庆医科大学动物中心健康成年清洁级雌性Balb/c小鼠50只（6~8周龄，18~20g），动物许可证号[SYXK（渝）2017-0023]。饲养环境为SPF级动物寄养室，饲养温度为（22±2）℃，相对湿度（55±10）%，12h光照，自由饮水进食。1.3主要的试剂Anti-LC3A/B（WesternBlot）、Anti-p62购自万类生物;Anti-Beclin-1购自SantaCruz公司;Anti-LC3B（免疫荧光）购自CellSignaling公司;Anti-β-actin购自北京中杉金桥生物技术有限公司。1.4实验动物分组及处理50只SPF级雌性Balb/c麻醉状态下鼻腔滴注浓度为1.5×109CFU/mL的肺炎链球菌D3920μL，于感染后0、6、12、24、48h5个时间点各随机抽取小鼠10只，麻醉状态下，用1mL无菌PBS液进行支气管肺泡灌洗（回抽率>80%），提取支气管肺泡灌洗液（BALF），每个时间点5只;另外5只取出左肺上叶-80℃冻存，右肺上叶及右肺下叶固定在4%甲醛溶液中。1.5肺组织病理检查右肺上叶于4%多聚甲醛溶液中固定48h，梯度乙醇脱水后常规石蜡包埋，切片，HE染色后光学微镜下观察。参照文献方法[8]对肺组织炎症浸润程度进行评分。1.6BALF细胞计数BALF用4℃离心机3500r/min离心10min，取沉淀，用500μL无菌PBS混匀，进行细胞涂片及瑞氏-吉姆萨染色，在光学显微镜下进行总细胞及中性粒细胞计数。1.7Westernblot免疫印迹法检测自噬相关蛋白Beclin-1、P62、LC3B的表达常规提取左肺上叶总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，以50μg总蛋白进行SDS-PAGE电泳，转膜0.5~1h，5%脱脂奶粉37℃恒温摇床封闭2h;一抗4℃孵育过夜;1%TBST洗膜3次，每次15min，二抗37℃恒温摇床孵育2h，1%TBST洗（6.272±1.312and3.456±1.308，respectively，bothP=0.000），reachedapeakat12h（19.456±0.997and15.040±1.012，respectively，bothP=0.000），anddecreasedtoanormallevelat48h（3.520±0.933and0.128±0.175，P=0.005and0.835，respectively），ascomparedwiththebaselinelevelsof1.280±0.506and0.000±0.000，respectively.Westernblotresultsshowedthattheautophagy-relatedproteinBeclin-1increasedfrom6hafterinfection（0.921±0.093，P=0.002）andreachedapeakat48h（1.884±0.158，P=0.000）comparedwiththebaselinelevelof0.626±0.078;theautophagy-relatedproteinP62decreasedfrom6hafterinfection（2.275±0.269，P=0.000）anddecreasedtoatroughlevelat48h（1.178±0.142，P=0.000）comparedwiththebaselinelevelof2.915±0.094;theautophagy-relatedproteinLC3Bincreasedfrom12hafterinfection（1.429±0.318，P=0.006），reachedapeakat24h（2.002±0.451，P=0.000），anddecreasedafter48h（1.563±0.501，P=0.002），ascomparedwiththebaselinelevelof0.747±0.197.ImmunofluorescenceassayshowedthattheexpressionofLC3Bproteinincreasedat12hand24hafterinfection.Conclusion:Afterinfectingthelungsofmice，Streptococcuspneumoniaeactivatesautophagy，whichplaysanimportantroleintheimmunemodulationinmice.[Keywords]autophagy;Streptococcuspneumoniae;Beclin-1;P62;microtubule-associatedprotein1lightchain3B747--重庆医科大学学报2019年第44卷第6期（JournalofChongqingMedicalUniversity2019.Vol.44No.6）膜3次，每次5min，ECL化学发光试剂盒显色。使用图像分析软件ImageQuantTL对光密度进行分析，最终结果以Beclin-1、P62、LC3B和内参β-actin的光密度比值表示。1.8免疫荧光法检测LC3B小鼠右下肺组织经4%多聚甲醛固定，10%、20%、30%蔗糖溶液梯度脱水，冰冻切片机切片。PBS溶液清洗3次，每次10min，荧光封闭液37℃恒温箱封闭30min;加入一抗工作液于4℃过夜，用PBS溶液代替一抗工作液设立阴性对照;37℃恒温箱复温1h，PBS溶液清洗3次，每次10min;加入二抗37℃恒温箱孵育1h，PBS溶液清洗3次，每次10min;DAPI染色5min，PBS清洗3次，每次10min。使用荧光显微镜观察LC3B荧光变化。1.9统计学处理采用SPSS17.0统计软件进行分析。所有数据以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组内两两比较采用LSD-t检验，检验水准α=0.05。2结果2.1肺组织病理检查鼻腔滴注1.5×109CFU/mL的肺炎链球菌D3920μL6h后，小鼠血管周围、支气管、细支气管周围出现炎症细胞浸润。随着时间的推移，炎症细胞浸润加重，肺泡间隔增厚，肺泡结构破坏，血管壁增厚（图1）。其肺组织炎症浸润程度评分如图2所示。2.2BALF中总细胞及中性粒细胞计数正常小鼠BALF中，主要以单核细胞为主。肺炎链球菌感染小鼠6h后，BALF中总细胞数量及中性粒细胞数量开始增高[（1.280±0.506）vs.（6.272±1.312），P=0.000;（0.000±0.000）vs.（3.456±1.308），P=0.000]，在12h时达到高峰[（1.280±0.506）vs.（19.456±0.997），P=0.000;（0.000±0.000）vs.（15.040±1.012），P=0.000]，48h后基本恢复正常水平图1小鼠鼻腔滴注浓度为1.5×109CFU/mLD3920μL后不同时间点肺组织病理切片注:，炎症细胞浸润0h6h12h24h48h200μm100μm50μm748--重庆医科大学学报2019年第44卷第6期（JournalofChongqingMedicalUniversity2019.Vol.44No.6）a:与0h组比较，P<0.05;b:与0h组比较，P<0.01;c:与0h比较，P<0.001图2小鼠鼻腔滴注浓度为1.5×109CFU/mLD3920μL后不同时间点肺组织病理评分（n=5）图3小鼠鼻腔滴注浓度为1.5×109CFU/mLD3920μL后不同时间点支气管肺泡灌洗液中总细胞及中性粒细胞计数情况（n=5）图4Westernblot检测不同时间点小鼠肺组织中Beclin-1、P62、LC3B蛋白的表达a:与0h组比较，P<0.05;b:与0h组比较，P<0.01;c:与0h比较，P<0.001图5小鼠鼻腔滴注浓度为1.5×109CFU/mLD3920μL后不同时间点小鼠肺组织中Beclin-1、P62、LC3B蛋白的表达（n=5）[（1.280±0.506）vs.（3.520±0.933），P=0.005;（0.000±0.000）vs.（0.128±0.175），P=0.835];如图3所示。2.4肺组织中Beclin-1、P62及LC3B蛋白表达水平的变化Westernblot结果显示:肺炎链球菌感染小鼠后，肺组织中Beclin-1蛋白逐渐增高，感染后48h仍处于较高水平[（0.626±0.078）vs.（1.884±0.158），P=0.000];肺组织中P62蛋白于感染后6h降低[（2.915±0.094）vs.（2.275±0.269），P=0.000]，感染后12h较感染后0h组明显降低[（2.915±0.094）vs.（1.564±0.228），P=0.000]，至48h仍处于较低水平[（2.915±0.094）vs.（1.178±0.142），P=0.000];肺组织中LC3B蛋白于感染后12h增高[（0.197±0.088）vs.（1.429±0.318），P=0.006]，至24h达到高峰[（0.747±0.197）vs.（2.002±0.451），P=0.000]，48h时较24h有所降低，但仍高于0h时水平[（0.747±0.197）vs.（1.563±0.501），P=0.002];如图4、图5所示。2.5免疫荧光法观察LC3B的表达LC3B在肺炎链球菌感染小鼠肺部后各个时间点均有表达，其中12h与24h较0h比较，LC3B的荧光信号明显增强，自噬细胞的数量增多[（3.333±1.528）%vs.（27.667±6.658）%，P=0.000;（3.333±1.528）%vs.（35.000±2.000）%，P=0.000）]。如图6、图7所示。3讨论肺炎链球菌是呼吸道内的常驻菌，在机体抵抗力下降时，特别是婴幼儿及年老体弱者，细菌更易侵袭致病，且预后大多不良[2]。肺炎链球菌是儿童呼吸道感染的常见致病菌，在全球小于5岁儿童中具有很高的致病率和致死率[3]。近年来因肺炎链球菌的耐药性逐渐增加、个体抵抗力低及诊治不及时等原因，最终引起的死亡成为目前医疗纠纷的案例之一。研究肺炎链球菌感染小鼠肺部模型，可为临床肺炎疾病的防治与法医学鉴定的病理诊断提供实验依据。肺炎链球菌可经呼吸进入下呼吸道，引起肺炎时间（h）61218243036424854bcca129630病理评分总细胞中性粒细胞时间（h）612182430364248540BALF中总细胞及中性粒细胞数量（104个/mL）0h6h12h24h48hBeclin-1P62LC3BLC3Aβ-actin60kD50kD47kD16kD14kD42kD时间（h）24481260Beclin-1的相对表达量2.52.01.51.00.50.0accc时间（h）24481260P62的相对表达量43210时间（h）24481260acbLC3B的相对表达量2.52.01.51.00.50.024201612840cccc749--重庆医科大学学报2019年第44卷第6期（JournalofChongqingMedicalUniversity2019.Vol.44No.6）a:与0h组比较，P<0.05;b:与0h组比较，P<0.01;c:与0h比较，P<0.001图7不同时间点自噬细胞百分比（n=3）注:，LC3B荧光信号增强图6免疫荧光观察不同时间点小鼠肺组织中LC3B蛋白的表达（400×）或中耳炎，也可经上皮细胞引起局部感染或菌血症[9]。本实验建立肺炎链球菌感染小鼠肺部模型，结果显示，肺组织及BALF中出现大量炎症细胞浸润，其中以中性粒细胞为主，提示小鼠肺部出现炎症反应，与Gomez等[10]肺炎链球菌感染小鼠肺部模型研究结果一致。当细菌入侵机体呼吸道，机体可通过不同途径清除入侵的病原菌，呼吸道上皮细胞与肺泡巨噬细胞分别可以通过纤毛运动、分泌黏液和吞噬作用清除部分病原菌，并在协同作用下合成趋化因子及其他细胞因子激活中性粒细胞，使中性粒细胞向感染部位聚集[9-12]。本实验发现，在感染后12h与24h，肺泡间隔增厚，肺泡结构破坏，血管壁明显增厚，支气管、细支气管管腔内大量炎症细胞聚集，其中以中性粒细胞为主，提示在此期间，肺部炎症浸润最明显，中性粒细胞在清除肺炎链球菌过程中发挥着重要作用。最近研究发现，真核细胞的自噬体具有清除病原微生物的功能，是上皮细胞、巨噬细胞、中性粒细胞清除病原微生物的机制之一，参与炎症的发生并在炎症反应过程中具有重要作用[13-15]。自噬是一种保守的细胞内降解途径，可通过双层膜将自身受损细胞器、蛋白质以及入侵病原菌包裹运输至溶酶体降解，维持细胞内环境稳定，包括自噬双层膜的形成、自噬体的形成、自噬体的运输与融合以及自噬体的降解4个阶段[16-17]。细胞吞噬细菌后，一方面，自噬时间（h）24481260accb403020100白噬细胞百分比（%）LC3BDAPIMerge0h6h12h24h48h20μm750--重庆医科大学学报2019年第44卷第6期（JournalofChongqingMedicalUniversity2019.Vol.44No.6）相关蛋白可促进包裹细菌的吞噬体与溶酶体结合，另一方面，自噬相关蛋白可捕获细胞内游离的细菌形成自噬体，并运输至溶酶体与溶酶体结合[18]。Beclin-1属于自噬相关蛋白家族，与Ⅲ类磷脂酰肌醇3激酶（ClassⅢPI3K）相结合构成自噬双层膜，并作为信号分子促进其他自噬相关蛋白的聚集，是参与调节自噬形成起始阶段的关键蛋白[19-21]。P62是自噬相关蛋白之一，在自噬形成过程中，P62作为底物不断被消耗，因而P62是反映自噬活性的关键蛋白[22]。LC3B是自噬特异性蛋白参与并调节自噬体的形成，是反映自噬活性的标志性蛋白[23]。本研究通过鼻腔滴注肺炎链球菌，建立肺炎链球菌感染小鼠肺部模型，结果显示，在感染后12、24及48h肺组织中自噬相关蛋白Beclin-1及LC3B的表达明显升高，P62的表达明显降低，与Li[13]和Ullah[24]等结果一致，提示肺炎链球菌可激活小鼠肺组织发生自噬，自噬活动在感染后12~48h期间最明显。相关研究表明，肺炎链球菌可通过抑制PI3K/AKT/mTOR通路从而激活A549细胞发生自噬，而通过药物抑制自噬后，细胞对细菌的清除减少，提示自噬活动能增强细胞对病原菌的清除[13]。综上所述，肺炎链球菌感染小鼠肺部后，可激活肺部发生自噬，而自噬的激活可能促进机体对细菌的清除，从而改善肺组织的损伤。而自噬在肺炎链球菌肺炎中具体的作用机制如何，需要进一步研究。参考文献[1]vanderPollT，OpalSM.Pathogenesis，treatment，andpreventionofpneumococcalpneumonia[J].Lancet，2009，374（9700）:1543-1556.[2]BogaertD，deGrootR，HermansPWM.Streptococcuspneumoniaecolonisation:thekeytopneumococcaldisease[J].LancetInfectDis，2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