缺血预处理通过激活自噬保护肾缺血-再灌注损伤
【摘要】 目的:探讨缺血预处理对缺血-再灌注所致急性肾损伤的保护作用与可能机制。方法:将健康雄性SD大鼠18只随机分为三组:假手术组(Sham组)、肾缺血组(I/R组)、实验组，Sham组大鼠开腹后游离左侧肾蒂血管，不夹闭，观察60min关闭腹部。I/R组大鼠开腹后切除右肾，左肾蒂血管分离，观察15min后用无损伤动脉夹持续夹闭左肾蒂血管45min后，关闭腹部，恢复左肾血流。实验组开腹后切除切除右肾，左肾蒂血管分离，行4个循环夹闭左肾蒂血管1min/再灌注4min预处理后，无损伤动脉持续夹闭45min，关闭腹部，恢复左肾血流。比较各组大鼠术后尿素氮值(Bureanitrogen，BUN)与肌酐值(Serumcreatinine，SCR)水平，肾组织病理学评分及微管相关蛋白轻链3(Microtubule-associatedproteinllightchain3，LC3)和自噬基因Beclin-1的表达。结果:所有大鼠在实验过程无死亡。I/R组、实验组再灌注后4h、24h的BUN与SCr值显著高于Sham组(P<0.05)，肾脏组织病理学评分显著高于Sham组(P<0.05)，实验组以上指标均显著低于I/R组(P<0.05);I/R组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值、Beclin-1相对表达量显著高于Sham组(P<0.05)，实验组以上指标均显著低于I/R组(P<0.05)。实验组大鼠再灌注后24hLC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值、Beclin-1相对表达量与肾组织病理学评分、BUN、SCr值呈显著相关性(P<0.05)。结论:缺血预处理可能通过激活自噬，减轻缺血-再灌注所致急性肾损伤，并改善肾功能。关键词:缺血预处理;自噬;肾损伤;肾功能中图分类号:R-33;R692文献标识码:A文章编号:1673-6273（2019）23-4421-04IschemicPreconditioningProtectsischemia-reperfusion-inducedacuteKidneyInjuryandRenalFibrosisbyActivatingAutophagy*CHENZhao,TIANLi-fang,MAXiao-tao,MAFang-xia,YAOTian,WANGLi△(Departmentofnephrological,TheSecondAffiliatedHospitalofXi'anJiaotongUniversity,Xi'an,Shaanxi,710000,China)ABSTRACTObjective:ToinvestigatetheprotectiveeffectandpossiblemechanismofIschemicpreconditioningonacutekidneyinjuryinducedbyischemia-reperfusion.Methods:18healthymaleSprague-Dawleyratswererandomlydividedintothreegroups:shamoperationgroup(Shamgroup),renalischemiagroup(I/Rgroup),andexperimentalgroup.TheratsintheShamgroupwerefreedfromtheleftrenalpedicleafterlaparotomy,withoutclipping,andtheabdomenwasobservedfor60min.IntheI/Rgroup,therightkidneywasexcisedafterlaparotomy,andtheleftrenalpediclewasseparated.After15minutes,theleftrenalpediclewascontinuouslyclampedwithanon-injuredarteryclipfor45min,thentheabdomenwasclosedandtheleftrenalbloodflowwasrestored.Intheexperimentalgroup,therightkidneywasremovedafterlaparotomy,andtheleftrenalpediclewasseparated.After4cyclesofclampingtheleftrenalpediclefor1min/reperfusionfor4min,theinjuredarterywascontinuouslyclampedfor45min,andtheabdomenwasclosedandrestored.Leftrenalbloodflow.ThelevelsofBUNandSCR,renalhistopathologyscoreandexpressionofLC3andBeclin-1werecomparedbetweenthegroups.Results:Allratsdidnotdieduringthecourseoftheexperiment.TheBUNandSCrvaluesintheI/Rgroupandtheexperi-mentalgroupweresignificantlyhigherthanthoseintheShamgroupat4hand24hafterreperfusion(P<0.05).ThehistopathologicalscoresofthekidneysweresignificantlyhigherthanthoseintheShamgroup(P<0.05).TheindicatorsweresignificantlylowerthantheI/Rgroup(P<0.05).TheratioofLC3-II/LC3-IandtherelativeexpressionofBeclin-1weresignificantlyhigherthanShamgroup(P<0.05).TheaboveindexesintheexperimentalgroupweresignificantlylowerthanthoseintheI/Rgroup(P<0.05).At24hafterreperfusion,theLC3-II/LC3-IratioandtherelativeexpressionofBeclin-1intheexperimentalgroupweresignificantlycorrelatedwithrenalhistopatho-logicalscores,BUNandSCrvalues(P<0.05).Conclusions:Ischemicpreconditioningmayattenuateacuterenalinjuryandinducedbyis-chemia-reperfusionandimproverenalfunctionbyactivatingautophagy.Keywords:Ischemicpreconditioning;Autophagy;Renalinjury;RenalfunctionChineseLibraryClassification(CLC):R-33;R692Documentcode:AArticleID:1673-6273(2019)23-4421-04*基金项目:陕西省社会发展科技攻关项目(2016SF-176)作者简介:陈钊(1983-)，女，硕士，主治医师，主要研究方向:慢性肾脏病，电话:13992820681，E-mail:chenzz0681@163.com△通讯作者:王莉（1977-），女，博士，副主任医师，主要研究方向:重症肾脏病，E-mail:lemonwine@126.com(收稿日期:2019-06-06接受日期:2019-06-30)4422··现代生物医学进展biomed.cnjournals.comProgressinModernBiomedicineVol.19NO.23DEC.2019前言持续夹闭45min，关闭腹部，恢复左肾血流。所有大鼠用75%酒精消毒后将大鼠放回鼠笼，给予正常急性肾衰竭是一种常见的临床危重病症，多伴随有急性肾饮食。损伤和肾纤维化，缺血再灌注(I/R)损伤是导致肾衰竭的重要因1.3观察指标素[1]。肾组织组织缺血后，氧供应突然减少，葡萄糖酵解代谢途三组大鼠于再灌注后4h、24h分别采血和肾脏标本，每个径供能并不能满足机体需要，代谢底物的减少更进一步加重能时间点各组各处死3只大鼠。将血液标本注入离心管，静置量的短缺，可导致细胞水肿、细胞内钙超载，从而引发一系列的30min，2500r/min离心15min，取上层血清标本，采用全自动细胞损伤[2,3]。而当缺血原因去除后，血液氧气、营养物质再次供生化分析仪测定尿素氮值(BUN)与肌酐值(SCR)。应，高浓度氧可激活髓过氧化物酶激，增加了细胞组织的损伤，肾脏标本也装入1.5mL离心管，-70℃冰箱保存，其中部且多为不可逆损伤[4,5]。分组织其重量加生理盐水制成10%的组织匀浆，采用Western缺血后处理(Ischemicpostconditioning，IPTC)预先通过反blotting检测肾组织中LC3、Beclin-1的表达，蛋白印迹荧光强复短暂的I/R，组织器官对随后长时间缺血产生耐受，从而诱导度采用积分光密度定量分析，以β-actin作为内标。另外，部分机体产生内源性保护机制，减轻脏器损伤[6,7]。在IPTC过程中，组织采用4%多聚甲醛固定，然后经脱水、透明、浸蜡、包埋，用机体组织与细胞自噬增强。自噬是指隔离膜将细胞质或(和)细苏木精-伊红染色，然后光镜下观察肾组织病理学变化，肾脏胞器包裹而形成的自噬体，接着融合溶酶体而形成了自噬溶酶的病理损害评分标准，1分:肾小管显著扩张、细胞扁平;1分:体，从而促使降解[8-10]。本研究主要探讨了缺血预处理对缺血-上皮细胞颗粒变性;2分;肾小管腔内有脱落、坏死的细胞;1再灌注所致急性肾损伤和肾纤维化的保护作用与可能机制。结分:空泡变性;1分:细胞核固缩;1分:肾阀质充血;1分:肾间果报告如下。1材料与方法1.1实验材料质炎性细胞浸润;0分:正常肾小管。分数越高，肾脏功能越差。1.4统计学分析用SPSS22.00软件分析数据，计量数据用均数±标准差表示，多组间对比采用单因素多样本均数方差分析，两组间比较健康雄性SD大鼠18只，体重250-280g，购自西安交通大采用t检验，计数数据用%表示，组间比较采用卡方检验，经以学，许可证SCXK(2018-0007)。动物房通风良好，自由饮食饮P<0.05为差异具有统计学意义。水，预适应3d后进行手术，术前12h禁食不禁水。1.2动物分组与处理2结果将上述大鼠随机平分为三组:假手术组(Sham组，n=6)、肾2.1造模情况缺血组(I/R组，n=6)、IPTC组(实验组，n=6)。I/R组、实验组大鼠肾缺血后肉眼观察肾脏颜色变为暗红Sham组:开腹后游离左侧肾蒂血管，不夹闭，观察60min色肾脏血流阻断，造成双侧肾缺血，缺血模型都建立成功，所有关闭腹部。大鼠在实验过程无死亡情况。I/R组:开腹后切除右肾，左肾蒂血管分离，观察15min后2.2各组肾功能生化指标变化对比用无损伤动脉夹持续夹闭左肾蒂血管45min后，关闭腹部，恢I/R组、实验组再灌注后4h、24h的BUN与SCr值显著高复左肾血流。于Sham组(P<0.05)，实验组以上指标显著低于I/R组(P<0.05)。实验组:开腹后切除切除右肾，左肾蒂血管分离，行4个循见表1。环夹闭左肾蒂血管1min/再灌注4min预处理后，无损伤动脉表1不同组别在不同时间点的肾功能指标变化的对比Table1Comparisonofthechangesofrenalfunctionatdifferenttimepointsamongdifferentgroups4h24hGroupsShamgroupI/RgroupBUN(mmol/L)7.22±1.33SCr(μmol/L)61.44±10.3118.42±2.18128.04±15.02Experimentalgroup14.13±2.4992.76±15.22FP14.2020.00011.0020.000BUN(mmol/L)7.42±1.0233.42±6.3120.37±4.5223.0140.000SCr(μmol/L)61.38±9.54256.09±33.18171.09±24.7627.0010.0002.3各组肾脏组织病理学评分的对比2.4各组肾组织LC3、Beclin-1表达的对比I/R组、实验组再灌注后4h、24h的肾脏组织病理学评分I/R组、实验组再灌注后4h、24h的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值、显著高于Sham组(P<0.05)，实验组以上指标均显著低于I/R组Beclin-1相对表达量均显著高于Sham组(P<0.05)，实验组以上(P<0.05)。见表2。指标明显显著低于I/R组(P<0.05)。见表3和图1。现代生物医学进展biomed.cnjournals.comProgressinModernBiomedicineVol.19NO.23DEC.20194423··表2不同组别在不同时间点的肾脏组织病理学评分的对比(分)Table2Comparisonoftherenalhistopathologyscoresatdifferenttimepointsamongdifferentgroups(scores)GroupsShamgroupI/RgroupExperimentalgroupFP4h0.53±0.145.46±0.404.51±0.4234.0220.00024h0.59±0.107.28±0.985.76±0.4643.1010.000Table3ComparisonoftheexpressionofLC3andBeclin-1intherenaltissuesatdifferenttimepointsamongdifferentgroups表3不同组别在不同时间点的肾组织LC3、Beclin-1表达的对比4h24hGroupsShamgroupI/RgroupExperimentalgroupFPLC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ1.03±0.245.20±0.832.67±0.619.8320.000Beclin-10.89±0.224.28±1.442.09±0.557.5530.008LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ1.11±0.326.88±1.424.21±1.447.3140.010Beclin-10.92±0.145.67±1.093.87±0.6110.0320.000相对表达与肾组织病理学评分、BUN、SCr值均呈显著相关性(P<0.05)，见表4。3讨论肾脏对缺血及I/R均非常敏感，再灌注可继续加重肾功能损伤[11]。但肾缺血45min左右的再灌注损伤是可逆的，超过60min的损伤基本为不可逆的。肾I/R损伤是影响肾衰竭患者的主要因素，因此对于肾脏再灌注损伤机制和治疗措施的研究一直是医学领域的热点。当前研究显示肾I/R损伤是由多种因素造成的复杂病理生理过程，缺血损伤可形成炎性介质前体并损图1各组不同时间点的肾组织LC3、Beclin-1表达的westernblot图伤亚致死性细胞，进一步加重损伤淋巴细胞、巨噬细胞、中性粒Fig.1ShowsthewesternblotoftheexpressionofLC3andBeclin-1in细胞，可导致无灌流区域的形成和引起缺血损伤[12,13]。本研究采renaltissuesatdifferenttimepointsineachgroup2.5相关性分析用夹闭双侧肾蒂的方法建立肾脏I/R损伤模型，I/R组Cr、BUN浓度水平显著升高，提示肾功能严重受损，且肉眼观察到肾脏组织颜色变为暗红色，且血流阻断，双侧肾缺血，提示肾缺血模实验组大鼠再灌注后24hLC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值、Beclin-1型建立成功。Table4Correlationbetweentheautophagylevelandrenalfunctionat24hafterreperfusionintheexperimentalgroup表4实验组大鼠再灌注后24h自噬水平与肾功能的相关性IndexesLC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ-rPBeclin-1expression-rPBUN0.5640.0010.4890.005SCr0.4530.0100.4130.013Renalhistopathologyscores0.7820.0000.6730.000如果机体对缺血产生耐受，则不会发生缺血性损伤或损伤120min有保护作用[16]。但也有研究显示延迟保护在最初缺血的程度显著减轻，特别是短时间的IPTC能显著减轻缺血引起后12h开始起效，12-24h达高峰[17]。本研究显示I/R组、实验组的损伤，但针对单一介质或机制的保护措施较难使机体获益[14,15]。再灌注后肾功能均较假手术组显著降低，而缺血预处理的大鼠有研究显示IPTC的保护时间是短暂的，仅在缺血和再灌注肾功能明显改善。I/R后肾脏形态结构可能受损，镜下可见肾小4424··现代生物医学进展biomed.cnjournals.comProgressinModernBiomedicineVol.19NO.23DEC.2019管扩张及部分结构损伤，肾小管上皮细胞肿胀和空泡变性，少损伤的保护作用及机制研究[J].湖南中医药大学学报,2018,38(1):量管腔内有蛋白性液体积聚，出现大量炎性细胞浸润等，这与21-26研究报道一致[18]，而缺血预处理可显著减轻以上病理变化。在大鼠心肌I/R模型中，预处理(缺血5min后再灌注5min)联合3次后处理(再灌注30s后再夹闭30s)对缺血60min再灌注3h心肌具有相同程度的保护作用，特别是IPTC可以增加环氧化酶-2的活性，也具有更好的肺脏保护作用[19,20]。IPTC的机制可能与直接清除自由基和抑制细胞凋亡有关[21-23]。肾脏IPTC的保护作用会随缺血预处理与再缺血时间间[7]CostaF,YamakiVN,TeixeiraRKC,etal.Perconditioningcombinedwithpostconditioningonkidneyischemiaandreperfusion[J].ActaCirBras,2017,32(8):599-606[8]HouJ,RaoM,ZhengW,etal.AdvancesonCellAutophagyandItsPotentialRegulatoryFactorsinRenalIschemia-ReperfusionInjury[J].DNACellBiol,2019[Epubaheadofprint][9]赵姣妹,欧册华,周军,等.阿片受体在肢体远程缺血后处理对脊髓保护中的作用[J].广东医学,2018,39(9):1337-1341隔的延长而减弱甚至丧失。自噬是一种降解和回收利用细胞中[10]黄璐璐,周芳芳,罗群.SIRT1对急性肾损伤保护机制的研究进展大分子和受损细胞器的过程[24-26]。自噬对肿瘤形成与炎症因子[J].中华急诊医学杂志,2018,27(7):811-814表达具有抑制作用，自噬性细胞死亡的形态学特征细胞质中出[11]王天宇,周江桥.线粒体自噬在肾缺血-再灌注损伤中的作用[J].现自噬溶酶体与自噬体。在生理情况下，自噬活性保持在较低器官移植,2018,9(3):239-241基础水平，在毒性物质、氧化应激等病理状态下，可使细胞自噬活性显著上调[27]。自噬作为细胞的一种保护性机制，在I/R损伤等诱导的多种肾衰竭模型中的近端小管上皮细胞中都有自噬形成。本研究显示I/R组、实验组再灌注后4h、24h的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值、Beclin-1相对表达量显著高于Sham组，实验组显著低于I/R组，表明IPTC对缺血肾脏的早期保护作用可能[12]GaoS,ZhuY,LiH,etal.Remoteischemicpostconditioningprotectsagainstrenalischemia/reperfusioninjurybyactivationofT-LAK-cell-originatedproteinkinase(TOPK)/PTEN/Aktsignalingpathwaymediatedanti-oxidationandanti-inflammation[J].IntImmunophar-macol,2016,38:395-401[13]HosszuA,AntalZ,LenartL,etal.σ1-ReceptorAgonismProtectsa-gainstRenalIschemia-ReperfusionInjury[J].JAmSocNephrol,是通过上调自噬作用实现。同时，本研究显示实验组大鼠再灌2017,28(1):152-165注后24h，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值、Beclin-1相对表达量与肾组织[14]JiangBT,ChenQZ,GuoZH,etal.Ischemicpost-conditioningatten-病理学评分、BUN、SCr值都呈显著相关性。自噬作为凋亡的上uatesrenalischemicreperfusioninjuryviadown-regulationof游通路调控凋亡发生发展，可在特定条件下自噬与凋亡通路拥toll-likereceptor4indiabeticrats[J].RenFail,2016,38(9):有不同的信号通路，形成相互独立的调控通路[28,29]。同时，自噬1425-1431与凋亡调控通路存在多重的交叉，两者可相互影响从而起到保护机体的作用[30,31]。总之，缺血预处理可能通过激活自噬，减轻缺血-再灌注所致急性肾损伤，并改善肾功能。本研究也有一定的不足，如IPTC有一定的时间窗，而本研究的时间点不足，且样本数量较[15]刘启祥,谢家恩,张立冬,等.丁香酚对大鼠肾缺血再灌注性损伤保护作用的研究[J].临床和实验医学杂志,2017,16(13):1261-1264[16]JonkerSJ,MentingTP,WarleMC,etal.PreclinicalEvidencefortheEfficacyofIschemicPostconditioningagainstRenalIschemia-Reper-fusionInjury,aSystematicReviewandMeta-Analysis[J].PLoSOne,少，具体机制分析还不够明确，将在后续研究中深入。2016,11(3):e0150863参考文献（References）[17]PontesHBD,PontesJ,AzevedoNetoE,etal.EvaluationoftheEf-[1]ArantesVM,BuenoRT,ModoloRP,etal.EffectsofIschemicPrecon-fectsofAtorvastatinandIschemicPostconditioningPreventingontheditioningandPostconditioninginaRenalIschemia-ReperfusionIn-IschemiaandReperfusionInjury:ExperimentalStudyinRats[J].BrazjuryModel:AComparativeExperimentalStudyinRats[J].Trans-JCardiovascSurg,2018,33(1):72-81plantProc,2018,50(10):3811-3815[18]YangH,LiR,ZhangL,etal.p53-cycloph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