山柰酚调控PI3K-Akt-mTOR通路诱导人结直肠癌RKO细胞自噬
【摘要】 目的研究山柰酚对人结直肠癌RKO细胞增殖和自噬的影响及其诱导自噬的作用机制。方法CCK-8法检测山柰酚溶液处理RKO细胞24h和48h后的细胞活力，计算半数抑制浓度（IC50）;流式细胞仪检测山柰酚对RKO细胞周期的影响;TUNEL染色检测山柰酚对RKO细胞凋亡的影响;MDC荧光染色检测山柰酚对RKO细胞自噬的影响;Westernblot检测山柰酚处理RKO细胞后自噬相关蛋白Beclin1和LC3及信号通路蛋白PI3K、Akt、p-Akt、mTOR和p-mTOR的表达水平。结果山柰酚处理RKO细胞24h和48h后的IC50分别为（41.52±1.09）、（25.07±0.81）mg·L-1。山柰酚能阻滞RKO细胞周期停留在G0/G1期。TUNEL染色实验显示山柰酚可诱导RKO细胞凋亡，且呈现浓度依赖性。MDC荧光染色结果表明，山柰酚诱导RKO细胞自噬体的形成，而自噬抑制剂3-MA可抑制山柰酚诱导RKO细胞自噬体的形成。Westernblot结果显示，在山柰酚的作用下，RKO细胞中自噬标志蛋白Beclin1表达水平上升、LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ比值降低;而3-MA抑制山柰酚引起的Beclin1蛋白表达水平上升和LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ比值降低。信号通路蛋白研究表明，山柰酚显著降低PI3K、p-Akt和p-mTOR蛋白表达，而Akt和mTOR蛋白表达量无明显变化。结论山柰酚可抑制人结直肠癌RKO细胞增殖并诱导其凋亡，同时可能通过下调PI3K/Akt/mTOR信号通路诱导RKO细胞自噬。关键词:山柰酚;结直肠癌;RKO细胞;自噬;PI3K/Akt/mTOR信号通路中图分类号:R285文献标识码:A文章编号:1672-2981(2020)10-1668-06doi:10.7539/j.issn.1672-2981.2020.10.010KaempferolinducesautophagyviaregulatingPI3K/Akt/mTORpathwayinRKOhumancolorectalcancercellsGUChao,WANGKai-chun,XUQin-fen,LIUWei,HUDao-de*(DepartmentofClinicalPharmacy,ShanghaiGeneralHospital,ShanghaiJiaoTongUniversity,Shanghai200080)Abstract:ObjectiveTodeterminetheeffectofkaempferolontheproliferationandautophagyofRKOhumancolorectalcancercellsanditsmechanismofinducingtheautophagy.MethodsThecellviabilityoftheRKOcellstreatedwithkaempferolatdifferentconcentrationsfor24hand48hwasdetectedbyCCK-8assay,andtheIC50valuesweremeasured.TheeffectofkaempferolonthecellcycleoftheRKOcellswasexaminedbyflowcytometry.TUNELstainingwasusedtodetecttheeffectofkaempferolontheapoptosisofRKOcells.TheeffectofkaempferolonautophagyoftheRKOcellswasdetectedbyMDCfluorescencestaining.Autophagy-relatedproteinsBeclin1,LC3andsignalingpathway-relatedproteinsPI3K,Akt,p-Akt,mTORandp-mTORintheRKOcellstreatedwithkaempferolweredeterminedbyWesternblot.ResultsTheIC50valuesofkaempferolactingontheRKOcellsfor24hand48hwere(41.52±1.09)mg·L-1and(25.07±0.81)mg·L-1respectively.KaempferolblockedRKOcellstoremaininG0/G1phase.TUNELstainingshowedthatkaempferolinducedtheapoptosisoftheRKOcellsinaconcentration-dependentmanner.MDCfluorescencestainingshowedthatkaempferolinducedtheformationofautophagosomesintheRKOcells,whiletheautophagyinhibitor3-MAinhibitedtheformationofautophagosomes.Westernblotshowedthattheexpressionofautophagy-relatedproteinBeclin1wasincreasedandtheLC3-Ⅰ/LC3-ⅡratiodecreasedinRKOcells,while3-MAinhibitedtheincreaseofBeclin1andthedecreaseoftheLC3-Ⅰ/LC3-Ⅱratio.Studiesonsignalingpathway-relatedproteinsshowedthatkaempferolsignificantlyreducedtheexpressionofPI3K,p-Aktandp-mTOR,whiletheexpressionofAktandmTORdidnotsignificantlychange.ConclusionKaempferolcan基金项目:上海市转化医学协同创新中心项目（No.TM201816）;上海市科委项目（No.16401901400）。作者简介:顾超，男，硕士研究生，主要从事药学方面的研究，E-mail:13661785852@163.com*通信作者:胡道德，男，教授，硕士研究生导师，主要从事药学方面的研究，E-mail:shanghaiyao@sina.com1668中南药学2020年10月第18卷第10期CentralSouthPharmacy.October,Vol.18No.10inhibittheproliferationandinducetheapoptosisoftheRKOhumancolorectalcancercells,andmayinducetheautophagythroughtheinhibitionofPI3K/Akt/mTORsignalingpathway.Keywords:kaempferol;colorectalcancer;RKOcell;autophagy;PI3K/Akt/mTORsignalingpathway结直肠癌（colorectalcancer，CRC）是一种常见的消化道恶性肿瘤。在全球恶性肿瘤中，其发病率排名第三位，死亡率排名第二位[1]。我国结直肠癌发病例数居于恶性肿瘤发病例数的第三位，死亡例数居于第五位[2]。结直肠癌的治疗方式主要有手术治疗，放射治疗和药物化疗。然而在治疗过程中可能会出现严重药物不良反应和肿瘤复发等情况，给患者造成极大的伤害，这些问题亟待解决。研究表明天然化合物如槲皮素[3]、姜黄素[4]和白藜芦醇[5]等对结直肠癌有潜在的治疗效果，并且几乎没有毒性，使用较为安全。山柰酚（kaempferol，KF）是一种在自然界中广泛分布的天然黄酮类化合物，它存在于多种水果和蔬菜中，例如苹果、草莓、西兰花和豆类等[6]，其化学结构式如图1所示。研究显示山柰酚有抗肿瘤、抗氧化和抗炎等作用[7]。有研究显示，山柰酚可抑制人结直肠癌RKO细胞的增殖[8]，但是具体的作用机制尚未完全阐明。本研究的目的是探究山柰酚对人结直肠癌RKO细胞凋亡和自噬的影响及其可能的作用机制，以期为结直肠癌的临床治疗提供潜在药物的可能。图1山柰酚的化学结构式Fig1Chemicalstructuralofkaempferol1材料1.1试药山柰酚（纯度≥98%，货号:B21126，上海源叶生物科技有限公司），人结直肠癌RKO细胞株（上海市第一人民医院普外科惠赠），DMEM培养基、胎牛血清和胰蛋白酶（Gibco公司），双抗（0.5%青霉素-链霉素，杭州吉诺生物科技有限公司），CCK-8试剂盒（日本同仁公司），碘化丙啶（PI，美国BD公司），TUNEL检测试剂盒（上海翊圣生物科技有限公司），DAPI染色液（碧云天生物科技有限公司），单丹磺酰尸胺（MDC，北京索莱宝科技有限公司），3-甲基腺嘌呤（3-MA，上海源叶生物科技有限公司），LC3、Beclin1、PI3K、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR和GAPDH抗体（美国CST公司）。1.2仪器AL104电子分析天平（梅特勒-托利多仪器有限公司），CO2培养箱（SANYO公司），W2010数控恒温水浴锅（上海申胜生物技术有限公司），倒置显微镜（德国Leica公司），高速台式离心机（Heraeus公司），酶标仪（Bio-Tek公司），BDAccuriC6流式细胞仪（美国BD公司），荧光显微镜（德国Leica公司），凝胶图像分析仪（美国Bio-rad公司）。2方法2.1细胞培养复苏RKO细胞，置于细胞培养皿中，加入含有10%胎牛血清和1%双抗的DMEM培养基，置37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养。2.2CCK-8法检测细胞活力取对数生长期的RKO细胞，调整细胞浓度为8×104个·mL-1，按每孔100μL的细胞悬液接种于96孔板，在培养箱中培养12h贴壁后弃去培养基。设置只加培养基的空白组、含有细胞和培养基的对照组和山柰酚10、20、40、80mg·L-1组，每孔保证最终体积为100μL，每组设5个复孔。细胞培养24h和48h后，吸去培养液，每孔加入10μL的CCK-8试剂和90μL的DMEM，继续培养2h后，酶标仪于450nm波长处测定各孔的吸光值A。细胞活力=（A实验组-A空白组）/（A对照组-A空白组）×100%，计算山柰酚对RKO细胞的半数抑制浓度（IC50）。实验重复3次。2.3细胞周期检测取对数生长期的RKO细胞，均匀加样于6孔板中，1×106个细胞/孔，置于培养箱中培养12h贴壁后，弃去培养基，设置阴性对照组和山柰酚10、20、40mg·L-1组，培养24h后，收集各孔细胞，加入95%预冷的乙醇，在4℃下固定12h后，用PBS清洗，加入100μL100μg·mL-1的RNaseA，37℃水浴30min，再加入500μLPI溶液，避光染色30min后，用流式细胞仪检测细胞周期，用Modfit软件分析结果。实验重复3次。2.4TUNEL染色检测细胞凋亡细胞接种和培养同“2.3”项下操作。设置阴性对照组和山柰酚10、20、40mg·L-1组，培养24h后，收集细胞悬液，离心洗涤后，重悬于PBS中，加在多聚赖氨酸包被的载玻片上，用4%多聚甲醛固定30min，PBS洗涤2次，再加入含0.2%TritonX-100的PBS中，室温孵育5min，PBS洗涤2次，加入50μLTUNEL检测液，37℃避光孵育1h，PBS洗涤2次，然后加入含2μg·mL-1DAPI的PBS中，室温孵育5min，去离子水洗涤3次，立即在荧光显微镜下观察并计数凋亡细胞，计算凋亡率。实验重复3次。2.5MDC荧光染色检测细胞自噬体细胞接种和培养同“2.3”项下操作。设置阴性对照组、山柰酚40mg·L-1组、自噬抑制剂3-MA组和1669CentralSouthPharmacy.October,Vol.18No.10中南药学2020年10月第18卷第10期3-MA+山柰酚40mg·L-1组（5mg·mL-1的3-MA预处理RKO细胞1.5h后加入40mg·L-1山柰酚），培养24h后，弃去培养基，用去离子水冲洗1次，每孔加入50μmol·L-1MDC溶液，室温避光染色30min，去离子水冲洗2次，在荧光显微镜下拍照，用ImageJ软件计算荧光强度。实验重复3次。2.6Westernblot检测蛋白表达水平细胞接种和培养同“2.3”项下方法操作。设置阴性对照组、山柰酚10、20、40mg·L-1组、3-MA组和3-MA+山柰酚40mg·L-1组，处理RKO细胞24h后，弃去培养基，加入预冷的细胞裂解液，冰上裂解30min，4℃、15000×g离心10min，取上清液，BCA法进行蛋白质定量，存于-20℃冰箱备用。SDS凝胶电泳后，转移至PVDF膜，在4℃加入一抗Beclin1、LC3、PI3K、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR和GAPDH（1∶1000稀释）孵育过夜，二抗（1∶1000稀释）室温孵育2h，ECL法显色，用ImageJ软件处理结果。实验重复3次。2.7统计分析处理采用GraphPadPrism7.0统计软件进行分析，数据符合正态分布以均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用方差分析（ANOVA），以P<0.05表示差异有统计学意义。3结果3.1山柰酚对RKO细胞增殖的影响从图2可以看出随着山柰酚浓度的升高（10、20、40、80mg·L-1）和作用时间的延长，细胞活力出现降低。山柰酚能够抑制RKO细胞增殖，且呈现出浓度和时间依赖性。山柰酚对RKO细胞在24h和48h的IC50分别是（41.52±1.09）、（25.07±0.81）mg·L-1，故后续实验选择10、20、40mg·L-1。图2山柰酚对RKO细胞增殖的影响Fig2EffectofkaempferolonRKOcellproliferation注:与对照组比较，**P<0.01。Note:Comparedwiththecontrolgroup，**P<0.01.3.2山柰酚对RKO细胞周期的影响山柰酚各浓度组细胞周期见图3和表1，山柰酚10、20、40mg·L-1组细胞G0/G1期比例显著高于对照组（P<0.01），山柰酚20、40mg·L-1组细胞S期比例显著低于对照组（P<0.05，P<0.01），而山柰酚各浓度组细胞G2/M期与对照组比较无明显变化。以上结果提示，山柰酚能通过抑制RKO细胞从G1期转变为S期，从而抑制细胞的增殖，使细胞阻滞于G0/G1期。1670图3山柰酚对RKO细胞周期的影响Fig3EffectofkaempferolonRKOcellcycleA.对照组（controlgroup）;B.山柰酚10mg·L-1组（kaempferol10mg·L-1group）;C.山柰酚20mg·L-1组（kaempferol20mg·L-1group）;D.山柰酚40mg·L-1组（kaempferol40mg·L-1group）表1山柰酚对RKO细胞周期的影响(%，x±s，n=3)Tab1EffectofkaempferolonRKOcellcycle(%，x±s，n=3)组别G0/G1期S期G2/M期（group）（G0/G1phase）对照组山柰酚10mg·L-1山柰酚20mg·L-1山柰酚40mg·L-1（Sphase）43.94±3.7942.15±1.6737.53±0.98*30.76±3.28**注:与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。Note:Comparedwiththecontrolgroup，*P<0.05，**P<0.01.（G2/Mphase）16.23±2.8312.93±1.1816.44±0.5620.65±1.8939.83±0.9644.92±0.49**46.03±0.41**48.60±1.39**3.3TUNEL染色检测细胞凋亡TUNEL染色检测结果显示，凋亡细胞发出绿色荧光，非凋亡细胞发出蓝色荧光。对照组细胞凋亡率为（9.11±0.89）%，山柰酚10、20、40mg·L-1组细胞凋亡率分别为（22.97±0.68）%、（43.56±0.93）%和（62.61±1.25）%。与对照组相比，山柰酚组凋亡率显著增高，差异有统计学意义（P<0.01），见图4。实验结果表明，山柰酚可诱导RKO细胞凋亡。3.4MDC荧光染色检测细胞自噬体MDC荧光染色结果显示，与对照组相比，山柰酚组荧光强度显著增强，差异有统计学意义（P<0.01）。利用自噬抑制剂3-MA对细胞进行预处理后发现，与山柰酚组比较，3-MA+山柰酚组荧光强度显著减弱，差异有统计学意义（P<0.01），见图5。表明山柰酚可诱导RKO细胞自噬体的形成，而3-MA抑制山柰酚诱导的RKO细胞自噬体的形成。3.5山柰酚对RKO细胞自噬蛋白表达的影响Westernblot法检测自噬相关蛋白的表达，山柰酚作用于RKO细胞24h后，检测出山柰酚各组Beclin1蛋白表达水平上升、LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ比值降低，与对照组相比，差异有统计学意义（P<0.01），见图6。3-MA预处理后的3-MA+山柰酚组与山柰酚组比较，Beclin1蛋白表达水平下降且LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ比值升高（P<0.01），见图7。表明山柰酚激活RKO细胞自噬相关蛋白分子的表达，而3-MA抑制自噬相关蛋白分子的表达。3.6山柰酚对RKO细胞相关信号通路蛋白表达的影响Westernblot法检测不同浓度山柰酚对RKO细胞PI3K/Akt/mTOR信号通路中关键蛋白表达的影响，山柰酚作用于RKO细胞24h后，检测出PI3K、p-Akt和p-mTOR蛋白表达量显著降低，与对照组相比，差中南药学2020年10月第18卷第10期CentralSouthPharmacy.October,Vol.18No.10图4山柰酚对RKO细胞凋亡的影响Fig4EffectofkaempferolonapoptosisofRKOcellsA.对照组（controlgroup）;B.山柰酚10mg·L-1组（kaempferol10mg·L-1group）;C.山柰酚20mg·L-1组（kaempferol20mg·L-1group）;D.山柰酚40mg·L-1组（kaempferol40mg·L-1group）图5山柰酚对RKO细胞自噬的影响Fig5EffectofkaempferolonautophagyofRKOcellsA.对照组（controlgroup）;B.3-MA组（3-MAgroup）;C.山柰酚组（kaempferolgroup）;D.3-MA+山柰酚组（3-MA+kaempferolgroup）注（Note）:与对照组比较，**P<0.01;与山柰酚组比较，##P<0.01（Comparedwiththecontrolgroup，**P<0.01;comparedwiththekaempferolgroup，##P<0.01）。图73-MA预处理后山柰酚对自噬蛋白表达的影响Fig7Effectofkaempferolontheexpressionofautophagyproteinafter3-MApretreatment注（Note）:与对照组比较，**P<0.01;与山柰酚组比较，##P<0.01（Comparedwiththecontrolgroup，**P<0.01;comparedwiththekaempferolgroup，##P<0.01）。异有统计学意义（P<0.05，P<0.01），而Akt和mTOR蛋白表达量无明显变化（P>0.05），见图8。图6山柰酚对RKO细胞自噬蛋白表达的影响Fig6EffectofkaempferolontheexpressionofautophagyproteininRKOcells注（Note）:与对照组比较，**P<0.01（Comparedwiththecontrolgroup，**P<0.01）。图8山柰酚对RKO细胞信号通路蛋白表达的影响Fig8EffectofkaempferolontheproteinexpressionofRKOcellsignalingpathway注（Note）:与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01（Comparedwiththecontrolgroup，*P<0.05，**P<0.01）。4讨论山柰酚是一种常见的天然黄酮类化合物，有研究报道，山柰酚具有对抗多种肿瘤的作用，包括胃癌[9]、食道癌[10]和乳腺癌[11]等。本文结果显示山柰酚有明1671CentralSouthPharmacy.October,Vol.18No.10中南药学2020年10月第18卷第10期显抑制RKO细胞增殖的作用，具有浓度依赖性和时间依赖性。细胞周期检测发现山柰酚能阻滞RKO细胞周期停留在G0/G1期。TUNEL染色实验常用于检测细胞的凋亡情况[12]，本次实验结果显示山柰酚可诱导RKO细胞凋亡且凋亡作用呈现浓度依赖性。以上结果表明山柰酚具有明显的抗肿瘤作用，是结直肠癌临床治疗潜在的高效、低毒性的药物或者先导化合物。自噬是一种细胞内的降解机制，是细胞内的囊泡包被特定的物质或细胞器，并与溶酶体融合形成自噬溶酶体，进行降解和再循环的过程[13]。细胞正常情况下保持着一种很低的、基础的自噬活性以维持稳态，而这种自噬基准水平会随着细胞内外各种诱导因素的变化而变化并达到平衡[14]。自噬对实现细胞代谢需要、更新细胞中的细胞器和维持细胞内稳态具有非常重要的作用[15]。自噬在肿瘤的发展和抗肿瘤治疗过程中既发挥促肿瘤作用又发挥抗肿瘤作用。自噬可以通过清除功能失调的蛋白或受损的细胞器来维持细胞稳态和基因组稳定性，从而在肿瘤发生早期阶段抑制肿瘤的形成[13]。当外界诱导因素刺激细胞时，细胞自噬水平会迅速升高，然而一旦自噬水平失调，过度的细胞自噬可以导致细胞凋亡[16]。有研究表明，山柰酚可以通过激活自噬诱导肿瘤细胞死亡[9，17]。MDC是一种常用于检测自噬体形成的标记染色剂[18-19]。本研究以MDC荧光染色结果发现，山柰酚显著诱导RKO细胞自噬体的形成。3-MA是常用的自噬抑制剂，可以抑制自噬前体的形成[20]。加入3-MA预处理RKO细胞后，自噬体形成显著减少。Beclin1和LC3蛋白是自噬过程中重要的蛋白。Beclinl是酵母自噬蛋白Atg6的同源物，是细胞自噬过程中最重要的正调节因子，通常通过自身的3个结构域与其他蛋白家族结合从而调控自噬[21]。LC3是参与自噬发生的关键蛋白，正常情况下，LC3的C端被Atg4蛋白酶酶切后生成胞质型LC3-Ⅰ。在自噬过程中，胞质型LC3-Ⅰ会被泛素化转变为膜型LC3-Ⅱ，吸附在自噬体膜上，从而将LC3与自噬小泡联系起来[22]。自噬体中LC3的存在，及其向LC3-Ⅱ的转化被用于指示自噬的发生。因此，Beclin1和LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ常用来作为评价自噬的指标[23-24]。本研究Westernblot结果可以看出山柰酚处理RKO细胞后，Beclin1蛋白表达水平上升，LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ比值降低，山柰酚能够诱导RKO细胞发生自噬。3-MA预处理RKO细胞后，Beclin1蛋白表达水平降低，LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ比值升高，表明自噬受到抑制，这与MDC荧光染色所观察到的结果一致。以上结果表明，山柰酚具有诱导RKO细胞自噬的作用。为进一步探讨山柰酚诱导RKO细胞自噬的分子机制，对PI3K/Akt/mTOR信号通路中的关键蛋白进行检测。PI3K/Akt/mTOR信号通路是参与细胞代谢、增殖和存活的重要信号通路，同时也是调控细胞自噬非常重要的一条信号通路[25]。PI3K/Akt/mTOR信号通路是一条抑制性通路，将其激活后可以抑制自噬使细胞免受凋亡，而抑制该通路则可以诱导细胞自噬[26]。PI3K是存在于胞质中的磷酸肌醇激酶，根据其蛋白结构和功能的差异可分为3型，其中对Ⅰ型PI3K的研究最为广泛。Ⅰ型PI3K激活后可使Akt磷酸化，Akt即蛋白激酶B，是PI3K下游的一个重要蛋白，具有丝/苏氨酸蛋白激酶活性，在Ⅰ型PI3K作用下形成p-Akt。PI3K/Akt在自噬的信号转导及细胞的存活、增殖和分化中起着关键性的作用。p-Akt可使mTOR激活形成p-mTOR，mTOR是哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammaliantargetofrapamycin），是PI3K/Akt下游的一种重要的蛋白激酶，mTOR通过调节葡萄糖代谢、蛋白质合成和基因转录在细胞的存活、生长、增殖、凋亡等生命活动中起着重要作用，同时也是自噬相关信号通路的核心[27]。mTOR对细胞自噬具有重要的负调控作用，即mTOR的激活能够抑制自噬，而抑制mTOR可以诱导自噬[28]。根据Westernblot结果发现，山柰酚具有下调PI3K/Akt/mTOR信号通路的作用，说明山柰酚可能通过PI3K/Akt/mTOR信号通路诱导RKO细胞发生自噬。综上所述，山柰酚可抑制人结直肠癌RKO细胞增殖并诱导其凋亡，同时可能通过下调PI3K/Akt/mTOR信号通路诱导RKO细胞自噬。这为山柰酚的临床应用提供了一定的理论参考，为结直肠癌的治疗提供了新的策略。参考文献[1]BrayF，FerlayJ，SoerjomataramI，etal.Globalcancerstatistics2018:GLOBOCANestimatesofincidenceandmortalityworldwidefor36cancersin185countries[J].CACancerJClin，2018，68（6）:394-424.[2]孙可欣，郑荣寿，张思维，等.2015年中国分地区恶性肿瘤发病和死亡分析[J].中国肿瘤，2019，28（1）:1-11.[3]DarbandSG，KavianiM，YousefiB，etal.Quercetin:Afunctionaldietaryflavonoidwithpotentialchemo-pre-ventivepropertiesincolorectalcancer[J].JCellPhysiol，2018，233（9）:6544-6560.[4]GuptaMK，VaddeR，SarojammaV.Curcumin-Anoveltherapeuticagentinthepreventionofcolorectalcancer[J].CurrDrugMetab，2019，20（12）:977-987.[5]LiuZ，WuX，LvJ，etal.Resveratrolinducesp53incol-orectalcancerthroughSET7/9[J].OncolLett，2019，17（4）:3783-3789.[6]ChenAY，ChenYC.Areviewofthedietaryflavonoid，kaempferolonhumanhealthandcancerchemopreven-tion[J].FoodChem，2013，138（4）:2099-2107.[7]ChoiJB，KimJH，LeeH，etal.Reactiveoxygenspeciesandp53mediatedactivationofp38andcaspasesiscritical-lyinvolvedinkaempferolinducedapoptosisincolorectalcancercells[J].JAgricFoodChem，2018，66（38）:9960-9967.[8]BudisanL，GuleiD，JurjA，etal.Inhibitoryeffectof1672中南药学2020年10月第18卷第10期CentralSouthPharmacy.October,Vol.18No.10CAPEandkaempferolincoloncancercelllines-possibleimplicationsinnewtherapeuticstrategies[J].IntJMolSci，2019，20（5）:1199.[9]KimTW，LeeSY，KimM，etal.KaempferolinducesautophagiccelldeathviaIRE1-JNK-CHOPpathwayandinhibitionofG9aingastriccancercells[J].CellDeathDis，2018，9（9）:875.[10]YaoS，WangX，LiC，etal.Kaempferolinhibitscellproliferationandglycolysisinesophagussquamouscellcar-cinomaviatargetingEGFRsignalingpathway[J].TumourBiol，2016，37（8）:10247-10256.[11]ZhuL，XueL.Kaempferolsuppressesproliferationandinducescellcyclearrest，apoptosis，andDNAdamageinbreastcancercells[J].OncolRes，2019，27（6）:629-634.[12]吴岩，王伟宏.伏利诺他联合顺铂对A549细胞的抑制作用及其机制研究[J].中南药学，2019，17（6）:836-841.[13]OnoratiAV，DyczynskiM，OjhaR，etal.Targetingauto-phagyincancer[J].Cancer，2018，124（16）:3307-3318.[14]曾丽君，凌江红，邓静，等.柴胡疏肝散对功能性消化不良大鼠胃窦肌间Cajal间质细胞自噬的影响[J].时珍国医国药，2017，28（5）:1041-1044.[15]刘虹，邵荣光.自噬在肿瘤发生与发展过程中的调节作用[J].药学学报，2016，51（1）:23-28.[16]贾亚萌，佟晓哲，范敬炎.巴西苏木素对舌癌Tca8113细胞凋亡和自噬的影响及分子机制[J].南方医科大学学报，2019，39（3）:351-356.[17]El-KottAF，ShatiAA，Al-KahtaniMA，etal.Kaemp-ferolinducescelldeathinA2780ovariancancercellsandincreasestheirsensitivitytocisplatinbyactivationofcyto-toxicendoplasmicreticulum-mediatedautophagyandinhi-bitionofproteinkinaseB[J].FoliaBiol（Praha），2020，66（1）:36-46.[18]ChengY，LiZ，XieJ，etal.MiRNA-224-5pinhibitsau-tophagyinbreastcancercellsviatargetingSmad4[J].Bio-chemBiophysResCommun，2018，506（4）:793-798.[19]YangX，ZhangJ，JiQ，etal.AutophagyprotectsMC3T3-E1cellsuponaluminum-inducedapoptosis[J].BiolTraceElemRes，2018，185（2）:433-439.[20]YangJW，ZhangQH，LiuT.Autophagyfacilitatesanti-cancereffectof5-fluorouracilinHCT-116cells[J].JCan-cerResTher，2018，14（12）:1141-1147.[21]李思漫，张金秀，朱晔，等.结直肠癌组织中Tricellu-lin、LC3和Beclin1的表达及意义[J].山东医药，2018，58（41）:1-5.[22]孔志伟，姚婷婷.自噬相关基因Beclin1和LC3与子宫内膜异位症的研究进展[J].医学综述，2019，25（21）:4166-4173.[23]JiangJ，DaiJ，CuiH.VitexinreversestheautophagydysfunctiontoattenuateMCAO-inducedcerebralischemicstrokeviamTOR/Ulk1pathway[J].BiomedPharmacother，2018，99:583-590.[24]WehKM，HowellAB，KrestyLA.Expression，mod-ulation，andclinicalcorrelatesoftheautophagyproteinBeclin-1inesophagealadenocarcinoma[J].MolCarcinog，2016，55（11）:1876-1885.[25]WangBJ，ZhengWL，FengNN，etal.TheeffectsofautophagyandPI3K/AKT/m-TORsignalingpathwayonthecell-cyclearrestofratsprimarysertolicellsinducedbyzearalenone[J].Toxins，2018，10（10）:398.[26]李鑫峰.苏木提取物对PI3K/Akt/mTOR信号通路介导的细胞自噬的影响[D].哈尔滨:黑龙江中医药大学，2019.[27]王鹏伟，高杉，徐一兰，等.基于mTOR信号通路探讨中医药干预冠心病研究进展[J].中草药，2018，49（21）:5191-5196.[28]FengFB，QiuHY.EffectsofArtesunateonchondrocyteproliferation，apoptosisandautophagythroughthePI3K/AKT/mTORsignalingpathwayinratmodelswithrheu-matoidarthritis[J].BiomedPharmacother，2018，102:1209-1220.（收稿日期:2020-05-07;修回日期:2020-07-14）1673
