白花蛇舌草-半枝莲药对乙酸乙酯组分对破骨细胞分化的抑制作用
【摘要】 目的研究白花蛇舌草⁃半枝莲药对乙酸乙酯组分（YDW11）对破骨细胞分化的抑制作用。方法UPLC⁃MS法鉴定YDW11中化学成分后，MTT法分析其对RAW2647细胞活力的影响。100ng/mL核因子⁃κB受体活化因子配体（RANKL）诱导RAW2647细胞7d以建立破骨细胞模型后，抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色考察TRAP阳性多核细胞数，相应试剂盒测定TRAP酶活性。QRT⁃PCR检测TRAP、树突状细胞⁃特异性跨膜蛋白（DC⁃STAMP）、活化T细胞核因子cl（NFATc1）基因表达，Westernblotting检测核因子κB受体活化因子（RANK）、肿瘤坏死因子受体相关因子6（TRAF6）、NFATc1、组织蛋白酶K蛋白表达，TaqmanMicroRNART⁃PCR检测miR⁃155表达。结果YDW11中有16种成分，鉴定出对羟基苯乙酮、野黄芩苷、木犀草素、芹菜素。与模型组比较，YDW11组（25、50μg/mL）阳性多核细胞数显著减少（P<001），并对细胞活力无明显影响（P>005）;呈剂量依赖性地显著抑制酶活性，TRAP、DC⁃STAMP、NFATc1基因表达，RANK、TRAF6、NFATc1、组织蛋白酶K蛋白表达（P<005），并显著提高miR⁃155表达（P<005）。结论YDW11可通过上调miR⁃155表达、下调相关基因和蛋白表达抑制RANKL诱导的破骨细胞分化。关键词:白花蛇舌草;半枝莲;药对;乙酸乙酯组分;破骨细胞;分化中图分类号:R2855doi:103969/j.issn.1001⁃1528201901010InhibitoryeffectsofethylacetatecomponentofHedyotisdiffusa⁃Scutellariabar⁃batadrugpaironosteoclastdifferentiation文章编号:1001⁃1528（2019）01⁃0044⁃07文献标志码:AXUYuan1，CHENLong2，ZHANGDan⁃dan1∗（1.InstituteofInterdisciplinaryIntegrativeMedicineResearch，ShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine，Shanghai201203，China;2.Analy⁃sisandTestLaboratory，ExperimentCenterforScienceandTechnology，ShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine，Shanghai201203，China）ABSTRACT:AIMTostudytheinhibitoryeffectsofethylacetatecomponentofHedyotisdiffusaWilld.-Scutel⁃lariabarbataD.Dondrugpair（YDW11）onosteoclastdifferentiation.METHODSAftertheidentificationofchemicalconstituentsinYDW11byUPLC⁃MS，theireffectonRAW2647cellviabilitywasanalyzedbyMTT.Os⁃teoclastmodelswereinducedviaRAW2647cellsby7dexposureto100ng/mLreceptoractivatorfornuclearfac⁃tor⁃κBligand（RANKL）.AndTRAPpostivepolykaryocytecountwasinvestigatedbytartrate⁃resistantacidphos⁃phatase（TRAP）staining，andtheTRAPenzymeactivitywasdeterminedbycorrespondingkit.Subsequently，thedetectionofTRAPgeneexpression，dendriticcells⁃specifictransmembraneprotein（DC⁃STAMP）andnuclearfactorofactivatedTcellscl（NFATc1）byQRT⁃PCR，theproteinexpressiondetectionofreceptoractivatorfornu⁃clearfactor⁃κB（RANK），tumornecrosisfactorreceptor⁃associatedfactor6（TRAF6），NFATc1andcathepsinKbyWesternblotting，andtheexpressiondetectionofmiR⁃155byTaqmanMicroRNART⁃PCRwereconducted.RESULTSAmongthesixteenconstituentsinYDW11，p⁃hydroxyacetophenone，scutellarein，luteolinand收稿日期:2018⁃01⁃07基金项目:国家自然科学基金项目（81001666，81573673，81773946）;上海教委创新项目（13YZ048）;上海卫计委青年项目作者简介:徐元（1992-），女，硕士生，从事抗肿瘤药物筛选及机制研究。Tel:（021）51322534，E⁃mail:2313390806@qq.com∗通信作者:章丹丹（1980-），女，博士，副研究员，从事中药干预肿瘤微环境机制研究。Tel:（021）51322534，E⁃mail:izhangdd@（20144Y0143）;上海教委优青项目（SZY07029）126.com44中成药ChineseTraditionalPatentMedicine半枝莲药对不同配比提取物及其不同极性组分进行January20192019年1月Vol.41No.1第41卷第1期apigeninwereidentified.Comparedwiththemodelgroup，YDW11groups（25，50μg/mL），leavingnoobviouseffectoncellviability（P>005），significantlyreducedpostivepolykaryocytecount（P<001），enzymeactivity，TRAP，DC⁃STAMP，NFATc1geneexpressions，RANK，TRAF6，NFATc1，cathepsinKproteinexpressions（P<005），andincreaseddose⁃dependentlymiR⁃155expression（P<005）.CONCLUSIONYDW11caninhibitRANKL⁃inducedosteoclastdifferentiationbyup⁃regulatingmiR⁃155expressionanddown⁃regulatingrelatedgeneandproteinexpressions.KEYWORDS:HedyotisdiffusaWilld.;ScutellariabarbataD.Don;drugpair;ethylacetatecomponent;osteo⁃clasts;differentiation风湿性关节炎、慢性病毒感染、肿瘤等疾病的发展过程中都伴有骨密度减少、破骨细胞异常活化[1⁃3]，同时乳腺癌、肺癌、前列腺癌晚期常见骨转移，其一旦发生将伴发病理性骨折、脊髓压迫、疼痛等，降低患者生活质量，甚至危及生命[4]。破骨细胞的分化依赖成骨细胞产生的核因子⁃κB受体活化因子配体（RANKL）与破骨细胞前体细胞膜上的核因子κB受体活化因子（RANK）相互作用活化，两者结合后促进骨吸收，并抑制破骨细胞凋亡[5]。中医药在干预乳腺癌等肿瘤中，不仅可抑制肿瘤生长，在转移环节还具有延缓骨转移发生及减少溶骨性损伤的作用。中医认为，肿瘤属于“岩证”“恶核”“石瘕”“石疽”等范畴，清热解毒、活血化瘀、扶正祛邪、软坚散结、化痰祛湿等是中医治疗肿瘤的常用方法[6]。白花蛇舌草味甘、淡，性凉，具有清热解毒、利尿消肿、活血止痛之功效[7];半枝莲味辛、苦，性寒，具有清热解毒、散瘀活血之功效[8]，两者均为清热解毒药，临床上常相须为用以治疗各种炎症、肿瘤等。现代药理研究表明，两者提取物或所含成分对结直肠癌、肝癌、膀胱癌等均具有抑制作用[9⁃11]，也是乳腺癌治疗的核心药对[12]，但尚未开展其对破骨细胞分化及肿瘤骨转移的研究。前期预实验对白花蛇舌草⁃活性导向的追踪分离，发现等比提取的乙酸乙酯组分抑制体外破骨细胞分化活性最强，故本实验基于RANKL诱导RAW2647细胞分化作为破骨细胞模型，探讨该组分抑制破骨细胞分化的机制，为其临床治疗肿瘤骨转移或其他骨性疾病提供参考。1材料11试药白花蛇舌草（批号050815）、半枝莲（批号050621）饮片购自上海养和堂药业连锁经营有限公司，经上海市食品药品检验所专家鉴定为正品（报告书编号20080338、20080337）。对羟基苯乙酮、野黄芩苷、木犀草素、芹菜素由上海中医药大学中药学院中药化学课题组提供，含有量均>98%。小鼠巨噬细胞株RAW2647购自美国ATCC公司;RPMI⁃1640培养基干粉购自美国Gibco公司;胎牛血清购自美国HyClone公司;噻唑蓝（MTT）、二甲基亚砜（DMSO）、TrizolRNA提取试剂、HighCapacitycDNAReverseTranscriptionKits、miR⁃155引物套装及TaqManSmallRNAAssays购自美国LifeTechnologies公司;RealMaster⁃MixSYBRGreen试剂盒购自美国罗氏公司;RANKL购自美国Peprotech公司;PVDF膜购自美国Millipore公司;BCA蛋白浓度测定试剂盒、抗技术有限公司;抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色试剂盒购自美国Sigma公司;RANK、肿瘤坏死因子受体相关因子6（TRAF6）、活化T细胞核因子cl（NFATc1）、组织蛋白酶K抗体购自美国SantaCruz公司;引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。其他溶剂均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。12仪器DeltaSeries生物安全柜（美国Labconco公司）;CO2培养箱、高分辨质谱仪（美国Thermo公司）;倒置显微镜（日本Olympus公司）;Centrifuge5810R低温高速离心机（德国Ep⁃pendorf公司）;CellometerAutoT4全自动细胞计数仪（美国Nexcelom公司）;SpectraMAX190酶标仪（美国MD公司）;QB⁃9006恒温微孔板快速振荡器（海门市其林贝尔仪器有限公司）;7500FastSystem荧光定量PCR仪（美国AppliedBiosystems公司）;PowerPacTMHC电泳仪（美国Bio⁃Rad公司）;TanonNIM2045凝胶成像系统（上海天能科技有限公司）;UPLC（美国Waters公司）。2方法21白花蛇舌草⁃半枝莲药对乙酸乙酯组分（YDW11）制备及成分鉴定白花蛇舌草、半枝莲54酒石酸酸性磷酸酶检测试剂盒购自上海碧云天生物中成药ChineseTraditionalPatentMedicine2019年1月第41卷第1期以1∶1比例加水提取，取适量浸膏溶于蒸馏水中，乙酸乙酯萃取，即得相应组分。取适量YDW11溶于DMSO溶液中，离子源喷雾电压正、负离子模式下分别为35、32kV;毛细管温度350℃;鞘气、辅助气体积流量35、15arb（1arb=03L/min）;反吹气体积流量1arb;离子源雾化温度300℃。S⁃Lens级别60;离子检测方式全扫描（FullScan），分辨率60000。二级采用10个峰的DDA检测模式（数据依赖分析模式）;分辨率15000;碰撞能35eV;动态排除时间10s。YDW11以5mg/mL质量浓度溶于甲醇中进行UPLC分析，条件为WatersAcquityUPLCHSST3色谱柱;流动相乙腈⁃01%甲酸;柱温40℃。22YDW11对细胞活力的影响RAW2647细胞以1×104/100μL密度接种于96孔板中，培养过夜，设置对照组、模型组、YDW11组（25、50μg/mL），刺激处理24h后弃去上清，每孔加入RPMI1640100μL、MTT（PBS溶解为5g/L）10μL，继续培养4h后弃去上清，加入100μLDMSO，置于摇床上至结晶完全溶解，酶标仪读取490nm下吸光度，以对照组为100%，计算YDW11对细胞活力的影响。每组设3个复孔，实验重复3次。23YDW11对阳性多核细胞数的影响RAW2647细胞在10%FBS1640条件下以10000/孔培养于24孔板中，分组同“22”项，贴壁生长过夜，第2天在相同条件下加药物预处理24h，第3天在相同条件下加入诱导剂RANKL（终质量浓度100ng/mL），再加入药物进行处理，隔天换液并加入上述诱导剂和药物，RANKL诱导处理7d后根据TRAP染色试剂盒说明书进行染色，200倍镜下随机选取5个视野观察细胞分化情况，具有3个及3个以上细胞核的多核细胞认定为破骨样细胞，对其进行计数，并进行典型破骨样细胞图像采集。实验重复3次。24TRAP活性检测RAW2647细胞在10%FBS1640条件下以10000/孔培养于24孔板中，分组同“22”项，贴壁生长过夜，第2天在相同条件下加药物预处理24h，第3天在相同条件加入诱导剂RANKL（终质量浓度100ng/mL），再加入药物进行处理，隔天换液并加入上述诱导剂和药物，诱导处理7d后弃去上清，PBS洗涤1次后每孔加入100μLPBS，刮取细胞并收集细胞悬液，150W64January2019Vol.41No.1下超声3次，每3s间歇2s，超声后4℃、12000r/min下离心15min，取上清，根据TRAP试剂盒说明书检测TRAP活性，同时采用BCA蛋白测定试剂盒测定样品蛋白浓度。实验重复3次。25YDW11对TRAP、树突状细胞⁃特异性跨膜蛋白（DC⁃STAMP）、NFATc1基因表达的影响RAW2647细胞在10%FBS1640条件下以10000/孔培养于24孔板中，分组同“22”项，贴壁生长过夜，第2天在洗脱条件下加药物预处理24h，第3天在相同条件下加入诱导剂RANKL（终质量浓度100ng/mL），再加入药物进行处理，隔天换液并加入上述诱导剂和药物，诱导处理7d后收集RNA样品，Trizol法提取RNA，根据样品吸光度计算RNA浓度，将其调整至500ng/μL，按RT试剂盒说明书逆转成cDNA样品后，根据PCR试剂盒说明书进行聚合酶链式反应。实验重复3次，引物序列见表1。表1引物序列基因TRAPDC⁃STAMPNFATc1GAPDHTab1Primersequences引物序列（5′⁃3′）正向TGACAAGAGGTTCCAGGA反向AGCCAGGACAGCTGAGTG正向CTGTGTTACTGAGGGCTCTTTG反向CAGAGAAGTCTTCCAGGATCTC正向GTCTCTTTCCCCGACATCAT反向TCTCCAAGTAACCGTGTAGC正向AACGGATTTGGTCGTATTGGG反向CAGGGGTGCTAAGCAGTTGG26YDW11对RANK、TRAF6、NFATc1、组织蛋白酶K蛋白表达的影响RAW2647细胞在10%FBS1640条件下以10000/孔培养于24孔板中，分组同“22”项，贴壁生长过夜，第2天在相同条件下加入药物预处理24h，第3天在相同条件下加入诱导剂RANKL（终质量浓度100ng/mL），再加入药物进行处理，隔天换液并加入上述诱导剂和药物，诱导处理7d后收集蛋白，100W下超声3次，每3s间歇2s，超声后4℃、12000r/min下离心15min，取上清，BCA蛋白测定试剂盒测定样品蛋白浓度，每孔上样30μg蛋白，在SDS⁃PAGE凝胶中电泳，转膜后5%牛奶封闭，检测RANK、TRAF6、NFATc1、cathepsinK蛋白表达。实验重复3次。27YDW11对miR⁃155表达的影响RAW2647细胞在10%FBS1640条件下以10000/孔培养于24孔板中，分组同“22”项，贴壁生长过夜，第2中成药ChineseTraditionalPatentMedicineJanuary2019Vol.41No.132YDW11对细胞活力的影响图2显示，与对照组比较，YDW11组对细胞活力无明显影响（P>005）。2019年1月第41卷第1期天在相同条件下加入药物预处理24h，第3天在相同条件下加入诱导剂RANKL（终质量浓度100ng/mL），再加入药物进行处理，隔天换液并加入上述诱导剂和药物，诱导处理7d后收集RNA样品，采用Trizol法提取总RNA，根据TaqmanSmallRNA试剂盒说明书，各样品取10ng总RNA，逆转成cDNA后进行PCR反应，检测miR⁃155表达。实验重复3次。28统计学分析通过SPSS210软件进行处理，组间资料比较采用单因素方差分析，计量资料以（x±s）表示。P<005表示差异有统计学意义。3结果31成分鉴定YDW11中可能含有16种成分。通过比较YDW11和各成分UPLC色谱图（图1），鉴定出对羟基苯乙酮、野黄芩苷、木犀草素、芹菜素。菜素1.YDW112.对羟基苯乙酮3.野黄芩苷4.木犀草素5.芹1.YDW112.p⁃hydroxyacetophenone3.scutellarein4.luteolin5.apigenin图1各成分UPLC色谱图Fig1UPLCchromatogramofvariousconstituents图2YDW11对细胞活力的影响Fig2EffectofYDW11oncellviability33YDW11对阳性多核细胞数的影响RAW2647细胞体积较小，镜下观察呈圆形、多角形等，一般只含有1个细胞核，极少数有2个核，TRAP染色阴性;与单核巨噬细胞比较，破骨细胞体积明显增大，部分细胞质可见空泡状，细胞核数≥3，TRAP染色阳性。图3显示，对照组无明显TRAP染色阳性多核细胞（细胞核≥3），模型组显著增加（P<001），YDW11组显著减少（P<001）。34YDW11对TRAP酶活性的影响图4显示，与对照组比较，模型组酶活性显著升高（P<005）;与模型组比较，YDW11组酶活性有所降低，以50μg/mL组更显著（P<005）。注:与对照组比较，＃＃P<001;与模型组比较，∗∗P<001图3YDW11对阳性多核细胞数的影响（×200）Fig3EffectofYDW11onpositivepolykaryocytecount（×200）742019年1月第41卷第1期注:与对照组比较，＃P<005;与模型组比较，∗P<005图4YDW11对TRAP酶活性的影响Fig4EffectofYDW11onTRAPenzymeactivity中成药ChineseTraditionalPatentMedicineJanuary2019Vol.41No.135YDW11对TRAP、DC⁃STAMP、NFATc1基因表达的影响图5显示，与对照组比较，模型组TRAP、DC⁃STAMP、NFATc1基因表达显著升高（P<001）;与模型组比较，YDW11组三者基因表达有所降低，以50μg/mL组更显著（P<005，P<001）。36YDW11对RANK、TRAF6、NFATc1、组织蛋白酶K蛋白表达的影响图6显示，与对照组比较，模型组RANK、TRAF6、NFATc1、组织蛋白酶蛋白表达显著升高（P<005，P<001）;与模型组比较，YDW11组三者蛋白表达显著降低（P<注:与对照组比较，＃P<005，＃＃P<001;与模型组比较，∗P<005，∗∗P<001图5YDW11对TRAP、DC⁃STAMP、NFATc1基因表达的影响Fig5EffectsofYDW11onTRAP，DC⁃STAMP，NFATc1geneexpressions注:与对照组比较，＃P<005，＃＃P<001;与模型组比较，∗P<005，∗∗P<001图6YDW11对RANK、TRAF6、NFATc1、组织蛋白酶K蛋白表达的影响Fig6EffectsofYDW11onRANK，TRAF6，NFATc1，cathepsinKproteinexpressions005，P<001），并呈剂量依赖性。37YDW11对miR⁃155表达的影响图7显示，与对照组比较，模型组miR⁃155表达显著下降84（P<005）;与模型组比较，YDW11组其表达有所升高，以50μg/mL组更显著（P<001）。2019年1月第41卷第1期注:与对照组比较，＃P<005;与模型组比较，∗∗P<001图7YDW11对miR⁃155表达的影响Fig7EffectofYDW11onmiR⁃155expression4讨论骨是一个代谢活跃的器官，在整个生命周期中都在进行不断的更新和改进。正常情况下，成骨细胞介导的骨基质合成、破骨细胞介导的骨吸收维持着骨完整性的平衡，数量与活性正常的两者对正常的骨转换至关重要，若功能失调将导致骨骼形态结构异常，如骨质疏松时骨量减少，而骨硬化症时骨量增多，当骨形成动态平衡被打破，破骨细胞介导的骨吸收大于成骨细胞介导的骨形成时，就会导致骨质疏松[13]。由在肿瘤发生骨转移时，常伴有骨密度减少及破骨细胞异常活化，故防治骨质疏松最重要的方式之一就是抑制破骨细胞活性、减少骨吸收。酸性磷酸酶也称为酸性磷酸酯酶，在酸性条件下可催化磷酸酯键水解，其主要分为两类，一类是抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP），一类是抗氟离子酸性磷酸酶[14]，其中前者是一种糖基化的含金属蛋白酶，主要存在于巨噬细胞、破骨细胞、Gaucher细胞、红细胞、血小板、脾脏毛状细胞、单核吞噬细胞中，但在肺泡巨噬细胞和破骨细胞中含有量最丰富，而单核细胞的前体则不含该酶[15]，它在细胞信号转导、细胞增殖、分化等方面起到重要作用[16]。本实验发现，经核因子⁃κB受体活化因子配体（RANKL）处理7d后，模型组中存在大量破骨细胞（细胞质呈空泡状、细胞核数目≥3、体积明显增大、TRAP染色阳性），但在白花蛇舌草⁃半枝莲药对乙酸乙酯组分（YDW11）干预下破骨细胞明显减少，同时TRAP表达及酶活性也被显著抑制。核因子⁃κB受体活化因子（RANK）是由其配体RANKL（TRANCE/OPGL/ODF）激活的在树突细胞上鉴定的TNFR家族成员，可促进树突状细胞存活和破骨细胞分化[13]。RANKL促进破骨细胞前中成药ChineseTraditionalPatentMedicineJanuary2019Vol.41No.1体分化的过程中，能诱导活化T细胞核因子cl（NFATcl）、树突状细胞⁃特异性跨膜蛋白（DC⁃STAMP）表达，而且前者可通过后者上调破骨细胞前体细胞间的融合，从而促进破骨细胞分化[17]。肿瘤坏死因子受体相关因子6（TRAF6）是NF⁃κB受体活化因子（RANK）的重要衔接分子，它与RANK的耦联对破骨细胞骨吸收功能的维持至关重要[18];组织蛋白酶K是一种溶酶体半胱氨酸蛋白酶，被认为在骨再吸收过程中由破骨细胞特异性表达[19]。本实验证实，YDW11可显著抑制破骨细胞分化重要蛋白和基因的表达，抑制破骨细胞分化。miRNA是一种在细胞分化、组织发育阶段特异性表达，主要参与基因转录后调节的内源性非编码单链小分子RNA，可通过与mRNA配对调节转录后基因表达使得翻译抑制或mRNA降解，在许多生理或病理过程中发挥关键作用，包括细胞分化、免疫发展、癌症转化等[20⁃21]。研究表明，多种miRNA在破骨细胞分化的过程中发挥了重要作用，如miR⁃223、miR⁃21、miR⁃503、miR⁃155等[2]，其中miR⁃155作为miRNAs家族一员，是一种炎症相关的多功能microRNA，与免疫功能和细胞凋亡有关，活化T细胞、B细胞、巨噬细胞可诱导其表达[20]。研究表明，在RAW2647向破骨细胞分化时，miR⁃155表达显著下降，而提升其表达可使破骨细胞分化受到抑制[22]。本实验发现，经RANKL处理7d后，模型组中miR⁃155表达显著降低，而YDW11在50μg/mL剂量下可大大提升其表达。中药复方配伍灵活多变，可依据症状种类及轻重辨证论治，随证加减，药对是中药诸多配伍形式中的一种，为其最小单位[23]。课题组前期对白花蛇舌草⁃半枝莲药对不同部位组分进行提取分离，寻找活性部位或成分，并对其中的化学成分进行初步分析和质量控制，有助于该药对药用价值的进一步开发。综上所述，YDW11可通过上调miR⁃155表达、下调相关基因和蛋白表达抑制RANKL诱导的破骨细胞分化，提示其具有抑制肿瘤骨转移的潜能，可为临床相关治疗提供一定参考。参考文献:[1]OshitaK，YamaokaK，TanakaY.Regulationofosteoclastogen⁃esisbyhumanmesenchymalstemcellsleadingtoapplicationofanoveltreatmentforrheumatoidarthritis[J].JUOEH，2013，35（1）:33⁃37.[2]KagiyaT.MicroRNAsandosteolyticbonemetastasis:Theroles94中成药ChineseTraditionalPatentMedicineJanuary2019Vol.41No.1herbalmedicineusedforbreastcancerpatients:Apopulation⁃basedstudy[J].EvidBasedComplementAlternatMed，2014，2014:202378.[13]ParkJH，LeeNK，LeeSY.CurrentunderstandingofRANKsignalinginosteoclastdifferentiationandmaturation[J].MolCells，2017，40（10）:706⁃713.[14]BullH，MurrayPG，ThomasD，etal.Acidphosphatases[J].MolPathol，2002，55（2）:65⁃72.[15]JanckilaAJ，NakasatoYR，NeustadtDH，etal.Disease⁃spe⁃cificexpressionoftartrate⁃resistantacidphosphataseisoforms[J].JBoneMinerRes，2003，18（10）:1916⁃1919.[16]SilvestrisF，CiavarellaS，DeMatteoM，etal.Bone⁃resorbingcellsinmultiplemyeloma:osteoclasts，myelomacellpolykary⁃ons，orboth?[J].Oncologist，2009，14（3）:264⁃275.[17]许娟.高糖对RANKL诱导的破骨细胞分化及ATP6vOd2、DC⁃STAMP表达水平的影响[D].济南:山东大学，2014.[18]曾祥周.青蒿琥酯对破骨细胞的作用和分子机制研究[D].广州:南方医科大学，2015.[19]何伟涛，刘康，孙金谞，等.组织蛋白酶k与骨质疏松症治疗的研究进展[J].中国骨质疏松杂志，2008，14（9）:670⁃673.[20]LiuQ，YangJ.ExpressionandsignificanceofmiR155andvas⁃cularendothelialgrowthfactorinplacentaofratswithpre⁃eclampsia[J].IntJClinExpMed，2015，8（9）:15731⁃15737.[21]DuF，YuF，WangY，etal.MicroRNA⁃155deficiencyresultsindecreasedmacrophageinflammationandattenuatedatherogen⁃esisinapolipoproteinE⁃deficientmice[J].ArteriosclerThrombVascBiol，2014，34（4）:759⁃767.[22]ZhangJ，ZhaoHY，ChenJP，etal.Interferon⁃β⁃inducedmiR⁃155inhibitsosteoclastdifferentiationbytargetingSOCS1andMITF[J].FEBSLett，2012，586（19）:3255⁃3262.[23]杨鸿珠，龚雨萍.中药药对的研究进展与思考[J].中国中西医结合杂志，2010，30（2）:218⁃220.2019年1月第41卷第1期[5]ofmicroRNAsintumor⁃inducedosteoclastdifferentiation[J].JClinMed，2015，4（9）:1741⁃1752.[3]BaumR，GravalleseEM.Impactofinflammationontheosteo⁃blastinrheumaticdiseases[J].CurrOsteoporosRep，2014，12（1）:9⁃16.[4]芦殿荣，芦殿香，冯利.中药治疗恶性肿瘤骨转移疼痛临床应用概述[J].中国实验方剂学杂志，2012，18（2）:251⁃253.IkedaK，TakeshitaS.Theroleofosteoclastdifferentiationandfunctioninskeletalhomeostasis[J].JBiochem，2016，159（1）:1⁃8.[6]李艳.扶正祛邪化毒法在肿瘤治疗中的应用[J].中医药临床杂志，2009，21（6）:487⁃489.[7]程琪庆，程春松，刘智祖，等.白花蛇舌草和水线草的鉴别与药用进展比较[J].中草药，2017，48（20）:4328⁃4338.[8]陈香爱，袁志芳，刘伟娜，等.不同产地半枝莲药材及其混淆品HPLC指纹图谱研究[J].中成药，2007，29（10）:1412⁃1415.[9]SunGD，WeiLH，FengJY，etal.InhibitoryeffectsofHedy⁃otisdiffusaWilld.oncolorectalcancerstemcells[J].OncolLett，2016，11（6）:3875⁃3881.[10]LiYL，ZhangJ，MinD，etal.Anticancereffectsof1，3⁃di⁃hydroxy⁃2⁃methylanthraquinoneandtheethylacetatefractionofHedyotisdiffusaWilldagainstHepG2carcinomacellsmediatedviaapoptosis[J].PLoSOne，2016，11（4）:e0151502.[11]PanLT，SheungY，GuoWP，etal.HedyotisdiffusaplusScutellariabarbatainducebladdercancercellapoptosisbyin⁃hibitingAktsignalingpathwaythroughdownregulatingmiR⁃155expression[J].EvidBasedComplementAlternatMed，2016，2016:9174903.[12]YehYC，ChenHY，YangSH，etal.Hedyotisdiffusacom⁃binedwithScutellariabarbataarethecoretreatmentofChinese05
