鼻咽癌中miR-421和FOXO4的表达及与放疗敏感性和预后的相关性
【摘要】 目的:研究鼻咽癌中miR-421和FOXO4的表达及与放疗敏感性和预后的相关性。方法:选择2013年1月-2015年12月期间在我院诊断为鼻咽癌并接受放疗的92例患者及同期经组织活检确诊的鼻咽部慢[收稿日期]2019-05-21[修回日期]2019-07-24[作者单位]中国人民解放军联勤保障部队第900医院耳鼻咽喉头颈外科，福建福州350025[作者简介]杨甫文（1968-），男，湖北汉川人，副主任医师，主要从事鼻咽癌诊断与治疗工作。E-mail:charles886@126.com[通讯作者]陈忠华（1970-），男，福建福州人，副主任医师，主要从事鼻咽癌放射治疗工作。E-mail:zyczhonghua@163.com现代肿瘤医学2021年05月第29卷第10期MODERNONCOLOGY，May2021，VOL29，No10·7961·性炎症的50例患者，检测miR-421、FOXO4的表达量，评价鼻咽癌患者的放疗敏感性、随访鼻咽癌患者的远期生存。结果:鼻咽癌组织中FOXO4的阳性表达率明显低于鼻咽部慢性炎症组织，miR-421的表达明显高于鼻咽部慢性炎症组织;T3-4期、N2-3期、M1期、临床III-IV期鼻咽癌组织中miR-421的表达量明显高于T1-2期、N0-1期、M0期、临床I-II期鼻咽癌组织，FOXO4的阳性率明显低于T1-2期、N0-1期、M0期、临床I-II期鼻咽癌组织;放疗不敏感的鼻咽癌组织中miR-421的表达量明显高于放疗敏感的鼻咽癌组织，FOXO4的阳性率明显低于放疗敏感的鼻咽癌组织;FOXO4阳性表达的鼻咽癌患者的无进展生存期及总生存期均明显优于FOXO4阴性表达的鼻咽癌患者。结论:miR-421/FOXO4途径的改变与鼻咽癌发生、病理进程、放疗敏感性及远期预后均密切相关。[关键词]鼻咽癌;miR-421;FOXO4;放疗敏感性;预后[中图分类号]R739.63[文献标识码]ADOI:10.3969/j.issn.1672-4992.2021.10.010[文章编号]1672-4992-（2021）10-1696-05鼻咽癌是起源于鼻咽黏膜上皮细胞的恶性肿瘤，是我国展至局部晚期、存在颈部淋巴结的转移。放疗是鼻咽癌的最最常见的头颈部恶性肿瘤之一，并且该病的发病具有明显的地域差异性，华南地区是我国鼻咽癌的高发地区[1-2]。目前，鼻咽癌的早期诊断难度较大，70%的新诊断患者已经发主要治疗手段，根据NCCN指南，II-IVb期鼻咽癌患者的推荐放疗剂量为68~70Gy，随着放疗技术的不断进步、鼻咽癌的局部控制率也得到了明显提高[3]。尽管如此，临床实践中最突出的问题是放疗剂量缺乏个体化，不同个体间对放疗的敏感性存在差异，进而在放疗效果、远期预后上也出现差别[4-5]，通过有效的辅助检查手段筛选出放疗敏感的鼻咽癌患者并进行精准治疗具有现实的临床价值。微小RNA（miRs）在恶性肿瘤发生发展中所起的作用在近年来受到越来越多的关注，miRs通过在转录后水平靶向调控基因的表达来产生不同的生物学效应。miR-421是具有促癌效应的miRs，能够靶向抑制促凋亡基因FOXO4的表达、削弱FOXO4介导的促凋亡作用，多种恶性肿瘤病灶内miR-421呈高表达趋势并且能够抑制癌细胞的凋亡、促进癌细胞的增殖。鼻咽癌相关的细胞实验结果表明，miR-421能够通过靶向抑制FOXO4的表达来促进鼻咽癌细胞增殖[6]，但miR-421/FOXO4途径是否影响鼻咽癌对放疗的敏感性尚未明确。本研究具体分析了鼻咽癌组织中miR-421和FOXO4的表达及其与放疗敏感性、远期预后的相关性，为将来鼻咽癌放疗敏感患者的筛选及疾病的精准治疗、远期预后判断提供依据。1资料与方法1.1临床资料选择2013年1月-2015年12月期间在我院诊断为鼻咽癌并接受放疗的92例患者，所有患者均经组织活检及病理诊断为低分化鳞状细胞癌，入组前未接受过放化疗，入组后接受单纯放疗。另取同期经组织活检确诊的鼻咽部慢性炎症的50例患者。鼻咽癌中男性53例、女性39例，年龄29~63岁、平均（42.31±7.94）岁;鼻咽部慢性炎症患者中男性28例、女性22例，年龄27~60岁、平均（41.41±8.41）岁。鼻咽癌患者与鼻咽部慢性炎症患者一般资料的比较无显著性差异（P>0.05）。1.2试剂及仪器miRNA提取试剂盒、miRNAcDNA第一链合成试剂盒、miRNA荧光定量PCR检测试剂盒及miR-421引物、U6引物均购自北京天根生物公司，SP法二步法免疫组化试剂盒购自北京中杉金桥生物公司，FOXO4的单克隆抗体购自Abcam公司。荧光定量PCR仪为Bio-rad公司，正置显微镜为Nikon公司。1.3miR-421表达的检测取鼻咽癌组织和鼻咽部慢性炎症组织，采用miRNA提取试剂盒分离组织中的miRNA，采用miRNAcDNA第一链合成试剂盒将miRNA反转录合成为cDNA，采用miRNA荧光定量PCR检测试剂盒对cDNA中的miR-421和U6进行扩增反应，反应程序为95℃预变性3分钟后95℃5s、60℃15s反应40个循环，自动生成循环曲线及循环阈值后，以U6为内参，计算miR-421的表达量。1.4FOXO4表达的检测取鼻咽癌组织和鼻咽部慢性炎症组织，石蜡包埋后制作厚度4μm的切片，采用SP二步法免疫组化试剂盒对FOXO4进行染色，磷酸盐缓冲液作为第一抗体的阴性对照。染色完成后，在显微镜的高倍视野（×400）下观察，细胞核呈达。棕黄色染色为阳性，计算视野内阳性细胞的百分比，百分比<5%定义为FOXO4阴性表达、百分比≥5%定义为阳性表1.5放疗敏感性的评价放疗结束后3个月复查鼻咽纤维镜、鼻咽部CT或MRI，根据RECIST标准判断疗效，包括完全缓解（CR）、部分缓解（PR）、稳定（SD）、进展（PD）。疗效达到CR和PR的患者判断为放疗敏感，SD和PD的患者判断为放疗不敏感。1.6预后随访本研究的所有鼻咽癌病例均获得随访，随访截止时间为2018年12月，随访方式包括门诊复查及电话回访，无进展生存期按照首次确诊至肿瘤进展或随访截止日期的时间计算，总生存期按照首次确诊至患者死亡或随访截止日期的时间计算。1.7统计学方法采用SPSS21.0软件录入数据并进行统计分析，计数资料的比较采用卡方检验、计量资料的比较采用t检验，生存分析采用Log-rank检验，P<0.05为差异有统计学意义。2结果2.1鼻咽癌中miR-421和FOXO4的表达免疫组化染色显示，FOXO4主要表达于细胞核，阳性染色呈棕黄色，在鼻咽部慢性炎症组织中的阳性表达率为68.00%（34/50）、在鼻咽癌组织中的阳性表达率为33.70%（31/92），见图1。鼻咽癌组织中FOXO4的阳性表达率明显低于鼻咽部慢性炎症组织，差异有统计学意义（χ2=10.327，P=0.001）。荧光定量PCR结果显示，鼻咽癌组织中miR-·8961·421的表达量为1.93±0.31、鼻咽部慢性炎症组织中miR-421的表达量为0.93±0.15。鼻咽癌组织中miR-421的表杨甫文，等鼻咽癌中miR-421和FOXO4的表达及与放疗敏感性和预后的相关性达明显高于鼻咽部慢性炎症组织，差异有统计学意义（t=21.460，P=0.000），见图2。图1鼻咽癌组织和鼻咽部慢性炎症组织中FOXO4的免疫组化染色（SP二步法免疫组化染色×400）A为鼻咽部慢性炎症组织的阴性对照染色;B为鼻咽部慢性炎症组织的FOXO4的免疫组化染色;C为鼻咽癌组织的阴性对照染色;D为鼻咽Fig.1ImmunohistochemicalstainingofFOXO4innasopharyngealcarcinomaandchronicinflammation（SPtwo-stepimmunohistochemicalstaining×癌组织的FOXO4的免疫组化染色。400）Aindicatenegativecontrolstainingofnasopharyngealchronicinflammationtissues;BindicateimmunohistochemicalstainingofFOXO4ofnasopharyngealchronicinflammationtissues;Cindicatenegativecontrolstainingofnasopharyngealcarcinomatissues;DindicateimmunohistochemicalstainingofFOXO4ofnasopharyngealcarcinomatissues.Log-rank分析显示，FOXO4阳性表达的鼻咽癌患者的无进展生存期及总生存期均明显优于FOXO4阴性表达的鼻咽癌患者，差异有统计学意义（P<0.05），见图3。3讨论放疗是临床上治疗鼻咽癌的重要手段，但鼻咽癌不同个体之间对放疗的敏感性存在差异并直接影响了放疗效果，再加以鼻咽癌容易在早期出现淋巴结转移，放疗效果不佳会增加远期复发风险并影响患者生存。在临床实践中，准确判断鼻咽癌的病情、筛选放疗敏感的人群进行精准治疗，对于改善预后具有积极价值。miR-421是与多种恶性肿瘤发生有关的miRs，在肺癌、乳腺癌、胃癌中均呈显著的高表达趋势[7-9]。在恶性肿瘤组织中，多种抑癌基因受到miR-421的靶向调控，其中FOXO4是受到miR-421调控并具有促凋亡效应的转录因子，能够增加caspase-3、caspase-9等基因的表达并启动凋亡的级联放大反应[10-11]。在鼻咽癌细胞中，已有研究证实miR-421能够靶向抑制FOXO4的表达并促进癌细胞增殖、抑制癌细胞凋亡[6]。在本研究中，鼻咽癌组织中miR-421的表达量明显高于鼻咽部慢性炎症组织，FOXO4的阳性表达率明显低于鼻咽部慢性炎症组织，说明miR-421的高表达、FOXO4的低表达与鼻咽癌的发生有关，结合miR-421在离体鼻咽癌细胞中所发挥的生物学效应及其对FOXO4的靶向抑制作用分析，鼻咽癌中高表达的miR-421能够引起FOXO4的表达下调并抑制癌细胞凋亡、促进癌细胞增殖，进而造成鼻咽癌病情的发展。在鼻咽癌的病情发展变化过程中，癌细胞的增殖和侵袭会引起肿瘤病理特征的改变[12-14]。本实验通过肿瘤的TNM分期及临床分期来反应鼻咽癌的病理特征并分析了其与miR-421和FOXO4表达的关系，T3-4期、N2-3期、M1期、临床III-IV期鼻咽癌组织中miR-421的表达量明显高于T1-2期、N0-1期、M0期、临床I-II期鼻咽癌组织，而FOXO4阳性率的变化与miR-421相反，表明miR-421/FOXO4途径的改变与病理特征的变化存在相关性，进而提示miR-421/FOXO4途径参与了鼻咽癌的病理进程。图2鼻咽癌组织和鼻咽部慢性炎症组织中miR-421表达的比较与鼻咽部慢性炎症组织比较，aP<0.05。Fig.2ComparionofmiR-421betweennasopharyngealcarcinomaandchronicinflammationComparedwithnasopharyngealchronicinflammationtissues，aP<0.05.2.2miR-421和FOXO4的表达与鼻咽癌临床病理特征的关系不同性别、年龄的鼻咽癌组织中，miR-421的表达量及FOXO4的阳性率均无显著性差异（P>0.05）;T3-4期鼻咽癌组织中miR-421的表达量明显高于T1-2期鼻咽癌组织，FOXO4的阳性率明显低于T1-2期鼻咽癌组织（P<0.05）;N2-3期鼻咽癌组织中miR-421的表达量明显高于N0-1期鼻咽癌组织，FOXO4的阳性率明显低于N0-1期鼻咽癌组织（P<0.05）;M1期鼻咽癌组织中miR-421的表达量明显高于M0期鼻咽癌组织，FOXO4的阳性率明显低于M0期鼻咽癌组织（P<0.05）;临床分期III-IV期鼻咽癌组织中miR-421的表达量明显高于临床分期I-II期鼻咽癌组织，FOXO4的阳性率明显低于临床分期I-II期鼻咽癌组织（P<0.05），见表1。2.3miR-421和FOXO4的表达与鼻咽癌放疗敏感性的放疗不敏感的鼻咽癌组织中miR-421的表达量明显高于放疗敏感的鼻咽癌组织，FOXO4的阳性率明显低于放疗敏感的鼻咽癌组织（P<0.05），见表2。2.4miR-421和FOXO4的表达与鼻咽癌预后的关系关系现代肿瘤医学2021年05月第29卷第10期MODERNONCOLOGY，May2021，VOL29，No10·9961·表1不同临床病理特征鼻咽癌组织中miR-421、FOXO4的比较Tab.1ComparisonofmiR-421，FOXO4innasopharyngealcarcinomawithdifferentclinicopathologicalfeaturesClinicopathologicalfeaturesGenderMaleFemaleAge（years）≥50<50TstageT1-2T3-4NstageN0-1N2-3MstageM0M1ClinicalstageI-IIIII-IVn533942505240444877153458miR-421expression（珋x±s）0.89±0.120.94±0.170.95±0.230.87±0.220.73±0.131.20±0.230.68±0.121.31±0.270.61±0.101.44±0.310.70±0.131.28±0.28t/P1.654/0.1021.702/0.09212.396/0.00014.237/0.00019.227/0.00011.363/0.000FOXO4positiveraten（%）18（33.96）13（33.33）14（33.33）17（34.00）22（42.31）9（22.50）21（47.73）10（20.83）22（28.57）9（60.00）18（52.94）13（22.41）χ2/P0.004/0.9500.005/0.9463.970/0.0467.432/0.0065.550/0.0188.941/0.003表2放疗不敏感和放疗敏感的鼻咽癌组织中miR-421、FOXO4的比较Tab.2ComparisonofmiR-421，FOXO4innasopharyngealcarcinomawhichsensitivitytoradiotherapyandinsensitivitytoradiotherapyRadiotherapysensitivitySensitivitytoradiotherapyInsensitivitytoradiotherapyt/χ2PnmiR-421expression（珋x±s）640.67±0.11FOXO4positiveraten（%）26（40.63）281.31±0.2915.3870.0005（17.86）4.5190.034在明确miR-421/FOXO4途径参与鼻咽癌的发生及病理进程后，本研究进一步分析了该途径对鼻咽癌放疗敏感性及预后的影响。放疗作为鼻咽癌最主要的治疗手段，癌细胞对放疗的敏感性直接决定了患者预后情况[15-16]，目前临床上尚缺乏能够有效预测鼻咽癌放疗敏感性的指标，单纯依靠病理特征能够判断鼻咽癌的恶性程度，但是对放疗敏感性的预测价值有限[17-18]。本研究在放疗后评价了疗效并判断了敏感性，放疗不敏感的鼻咽癌组织中miR-421的表达量明显高于放疗敏感的鼻咽癌组织、FOXO4的阳性率明显低于放疗敏感的鼻咽癌组织，说明miR-421/FOXO4途径的改变与鼻咽癌放疗敏感性的变化有关，miR-421的高表达、FOXO4的低表达可能通过促进细胞凋亡、抑制细胞增殖的方式来增加放疗敏感性。在此基础上对放疗后远期的病情转归进行了随访，FOXO4阳性表达的鼻咽癌患者的无进展生存期及总生存期均明显优于FOXO4阴性表达的鼻咽癌患者，说明miR-421高表达对FOXO4表达的抑制能够影响患者的远期生存、使病情转归恶化。图3鼻咽癌患者的生存曲线A为无进展生存期的生存曲线;B为总生存期的生存曲线。Fig.3SurvivalcurveofnasopharyngealcarcinomapatientsAindicatethesurvivalcurveofprogression-freesurvival;Bindicatethesurvivalcurveofoverallsurvival.综上所述，miR-421/FOXO4途径的改变与鼻咽癌发生、病理进程、放疗敏感性及远期预后均密切相关，miR-421表达增多并靶向抑制FOXO4的表达能够促进鼻咽癌的发生、病理进程的发展、放疗敏感性的下降及远期预后的恶化，今后可进一步设计离体细胞实验来验证miR-421/FOXO4途径对鼻咽癌细胞放疗敏感性的直接调控作用。·0071·杨甫文，等鼻咽癌中miR-421和FOXO4的表达及与放疗敏感性和预后的相关性[参考文献][1]LIUX，TANGLL，DUXJ，etal.Changesindiseasefailureriskofnasopharyngealcarcinomaovertime:analysisof749patientswithlong-termfollow-up[J].JCancer，2017，8（3）:455-459.[2]刘晓雪，张志将，宇传华.中国居民1987-2015年鼻咽癌死亡趋势[J].中南大学学报（医学版），2018，43（7）:760-766.LIUXX，ZHANGZJ，YUCH.MortalitytrendinnasopharynxcancerinChineseresidentfrom1987to2015[J].JournalofCentralSouthUniversity（MedicalScience），2018，43（7）:760-766.[3]虞鲁诗，宋启斌，韩光.2017鼻咽癌国际临床靶区勾画指南解读[J].肿瘤防治研究，2019，46（1）:85-92.YULS，SONGQB，HANG.Aninterpretationofinternationalguidelinefordelineationofclinicaltargetvolumesfornasopharyngealcarcinomain2017[J].CancerResearchonPreventionandTreatment，2019，46（1）:85-92.[4]洪朝欣，陈斌，罗丹凤，等.常规放疗与调强放疗对中晚期鼻咽癌患者早期不良反应及生存质量的影响[J].医学临床研究，2018，35（2）:401-403.HANGCX，CHENB，LUODF，etal.Effectsofconventionalradiotherapyandintensity-modulatedradiotherapyonearlyadversereactionsandqualityoflifeinpatientswithadvancednasopharyngealcarcinoma[J].JournalofClinicalResearch，2018，35（2）:401-403.[5]陈舒婷，杨帅，姜仁伟，等.鼻咽癌IMRT与VMAT治疗计划的比较[J].临床检验杂志（电子版），2018，7（4）:723-724.CHENST，YANGS，JIANGRW，etal.ComparisonofIMRTandVMATtreatmentplansfornasopharyngealcarcinoma[J].ClinicalLaboratoryJournal（ElectronicEdition），2018，7（4）:723-724.[6]CHENL，TANGY，WANGJ，etal.miR-421inducescellproliferationandapoptosisresistanceinhumannasopharyngealcarcinomaviadownregulationofFOXO4[J].BiochemBiophysResCommun，2013，435（4）:745-750.[7]LIY，CUIX，LIY，etal.UpregulatedexpressionofmiR-421isassociatedwithpoorprognosisinnon-small-celllungcancer[J].CancerManagRes，2018，13（10）:2627-2633.[8]HUTB，CHENHS，CAOMQ，etal.MicroRNA-421inhibitscaspase-10expressionandpromotesbreastcancerprogression[J].Neoplasma，2018，65（1）:49-54.[9]LIUH，GAOY，SONGD，etal.CorrelationbetweenmicroRNA-421expressionlevelandprognosisofgastriccancer[J].IntJClinExpPathol，2015，8（11）:15128-15132.[10]BERETTAGL，CORNOC，ZAFFARONIN，etal.RoleofFoxOproteinsincellularresponsetoantitumoragents[J].Cancers（Basel），2019，11（1）:E90.[11]BOURGEOISB，MADLT.RegulationofcellularsenescenceviatheFOXO4-p53axis[J].FEBSLett，2018，592（12）:2083-2097.[12]WANGJY，JINX，LIXF.KnockdownofTMPRSS3，atransmembraneserineprotease，inhibitsproliferation，migration，andinvasioninhumannasopharyngealcarcinomacells[J].OncolRes，2018，26（1）:95-101.[13]WANGH，CHENH，ZHOUH，etal.Cyclin-dependentkinaseinhibitor3promotescancercellproliferationandtumorigenesisinnasopharyngealcarcinomabytargetingp27[J].OncolRes，2017，25（9）:1431-1440.[14]ZENGR，TANG，LIW，etal.IncreasedexpressionofCullin3innasopharyngealcarcinomaandknockdowninhibitsproliferationandinvasion[J].OncolRes，2018，26（1）:111-122.[15]LOUJ，HUANGP，MAC，etal.Parotidglandradiationdose-xerostomiarelationshipsbasedonactualdelivereddosefornasopharyngealcarcinoma[J].JApplClinMedPhys，2018，19（3）:251-260.[16]YANGH，CHENX，LINS，etal.Treatmentoutcomesafterreductionofthetargetvolumeofintensity-modulatedradiotherapyfollowinginductionchemotherapyinpatientswithlocoregionallyadvancednasopharyngealcarcinoma:Aprospective，multi-center，randomizedclinicaltrial[J].RadiotherOncol，2018，126（1）:37-42.[17]QINY，YUX，HOUJ，etal.Predictingchemoradiotherapyresponseofnasopharyngealcarcinomausingtexturefeaturesbasedonintravoxelincoherentmotiondiffusion-weightedimaging[J].Medicine（Baltimore），2018，97（30）:e11676.[18]ZHAOL，CHENH，HUB，etal.PrognosticsignificanceofKi67expressionandthederivedneutrophil-lymphocyteratioinnasopharyngealcarcinoma[J].CancerManagRes，2018，10:1919-1926.（编校:闫沛）
