超声激励bFGF微泡促进组织细胞转染的体外实验研究
【摘要】 目的利用超声激励微泡促进碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）目的基因表达，为组织修复提供细胞水平基础。方法构建并提取bFGF目的基因质粒，其含有增强型绿色荧光蛋白（EGFP）作为标记基因，制备并鉴定含bFGF-EGFP基因微泡。将细胞成功分离、培养后，在不同实验条件下（质粒质量浓度、声强、辐照时间和占空比）进行超声激励微泡参数优化，根据每组条件下最优的细胞存活率和标记基因转染效率所对应的参数作为后续实验超声辐照条件。实验分为4组:A组为对照组，B组为单纯bFGF-EGFP质粒组，C组为超声辐照+普通脂质微泡组，D组为超声辐照+bFGF-EGFP微泡组。细胞转染24h后，在倒置荧光显微镜下观察EGFP表达情况;转染48h后，用流式细胞仪检测转染效率，CCK8法检测细胞存活率，逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）和Westernblot分别检测mRNA和蛋白的相对表达量，并比较4组间的差异来评价超声激励bFGF微泡在细胞水平的生物学效应。结果携带bFGF-EGFP质粒微泡粒径大小约为（941.7±101.2）nm，Zeta电位大小约为（20.8±4.5）mV。实验研究中最优超声参数为质粒质量浓度20μg/mL，声强1.50W/cm2，辐照时间60s，占空比40%。细胞转染24h后，A组和C组未见明显EGFP表达，B组有少量EGFP表达，而D组EGFP表达量明显增多。转染48h后，4组细胞存活率均>80%，各组间差异无统计学意义（P>0.05）。流式细胞仪测量转染效率在D组[（60.0±7.9）%]较其他各组明显增加，差异有统计学意义（P<0.05）。转染48h后，超声激励目的基因bFGF转染后D组mRNA[（45.0±5.1）%]和蛋白相对表达量[（35.0±5.0）%]均明显增高，而D组Ⅰ型胶原蛋白[（9.1±3.0）%]和Ⅲ型胶原蛋白[（11.2±3.1）%]较其他组均明显降低，差异均有统计学意义（P<0.05）。结论超声优化参数激励bFGF微泡可提高细胞转染效率并保持较高的细胞活性，促进bFGF表达效率并抑制Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白;这种超声物理效应和bFGF生物效应相结合的方式为皮肤组织在细胞水平修复提供了新策略。关键词:超声波;碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）;微泡;bFGF基因;物理效应;生物效应中图分类号:R318;Q785文章编号:1009-7090（2021）03-0264-07文献标识码:AInvitroexperimentalstudyofultrasound-inducedbFGFnano-microbubblespromotingtherepairoftissueatcellularlevel(a.DepartmentofUltrasound;b.DepartmentofBurn,WuhanThirdHospital,Wuhan430060,Hubei,China)CHENCui-lana,CHENKea,HUANGLia,LEIFangb,XIEWei-guobAbstract:ObjectiveToprovideacelllevelbasisfortissuerepair,byusingultrasoundstimulatedmicrobubblestopromotetargetedgeneexpressionofbasicfibroblastgrowthfactor(bFGF).MethodsThetargetedgeneplasmidscontainingenhancedgreenfluorescentprotein(EGFP)wereconstructedandextracted.Afterthecellsweresuccessfullyisolatedandcultured,theparame-tersoftheultrasonicstimulatedmicrobubbleswereoptimizedunderdifferentexperimentalconditions(plasmidconcentration,in-tensityoftheultrasound,irradiationtimeanddutycycle).Theparameterscorrespondingtotheoptimalcellsurvivalrateandtransfectionefficiencyofthelabeledgenesineachgroupwereusedastheoptimalconditionsfortheultrasoniccavitationef-fectinthesubsequentexperiments.Fourgroupsweresetupforthestudy:groupAascontrolgroup,groupBassinglebFGF-EGFPplasmidgroup,groupCasultrasound+lipidmicrobubblegroup,groupDasultrasound+bFGF-EGFPnanobubblesgroup.Twenty-fourhoursaftertransfection,invertedfluorescencemicroscopewasusedtoobserveEGFPexpression.Forty-eighthoursaftertransfection,thecellsweredetectedforthetransfectionefficiencybyflowcytometry,survivalratebyCCK8,mRNAandproteinexpressionbyreversetranscriptionpolymerasechainreaction(RT-PCR)andWesternblottesting,respec-tively,andthedifferenceswerecomparedwithin4groupstoevaluatethebiologicaleffectsofultrasonicirradiatedbFGFnano-microbubblesatcellularlevel.ResultsTheparticlesizeofthebFGF-EGFPplasmidwas(941.7±101.2)nm,andtheZetapoten-tialwas(20.8±4.5)mV.Theoptimalultrasonicparametersinthisstudywere:plasmidconcentration20μg/mL,theultrasoundin-tensity1.50W/cm2,irradiationtime60s,dutycycle40%.Twenty-fourhoursaftertransfection,nosignificantEGFPexpressionwasobservedingroupAandgroupC,littlewasingroupB,whiletheexpressionofEGFPwassignificantlyincreasedingroupD.Forty-eighthoursaftertransfection,thecellsurvivalratesofall4groupswere>80%,withnostatisticallysignificantdif-ferencewasobserved(P>0.05).ThetransfectionefficiencymeasuredbyflowcytometrywassignificantlyincreasedingroupD[(60.0±7.9)%]comparedwithothergroups,andthedifferenceswerestatisticallysignificant(P<0.05).Forty-eighthoursaf-作者单位:武汉市第三医院a.超声科;b.烧伤科，湖北武汉430060作者简介:陈翠兰（1962-），女，湖北武汉市人，本科，副主任医师，主要从事浅表器官疾病的超声诊断与治疗。电话:13971226845。E-mail:503130721@qq.com。基金项目:武汉市卫生健康科研基金资助项目（WX19C24）版权C保护，不得翻录。生物医学工程与临床2021年5月第25卷第3期BME&ClinMed,May2021,Vol.25,No.3-265-tertransfection,therelativeexpressionsofmRNA[(45.0±5.1)%]andprotein[(35.0±5.0)%]ofthetargetgenebFGFtrans-fectedbyultrasoundweresignificantlyincreasedingroupD,whiletypeⅠcollagen[(9.1±3.0)%]andⅢcollagen[(11.2±3.1)%]weresignificantlydecreasedingroupDcomparedwithothergroups,withstatisticallysignificantdifferences(P<0.05).Con-clusionThesuccessfulstimulationofbFGFmicrobubblesbyultrasoundwithoptimizedparameterscanimprovethetransfec-tionefficiencyandmaintainhighcellactivityatthecellularlevel,prompttheexpressionofbFGFandinhibittheexpressionoftypeⅠandⅢcollagen,whichmayprovideanewstrategyforthestimulationofskinrepairatcellularlevel.Keywords:ultrasonicwave;basicfibroblastgrowthfactor(bFGF);microbubble;bFGFgene;physicaleffects;biologicaleffects严重的皮肤损伤后，如何促进创伤后组织尽快愈1.1.2主要仪器及型号合，并防止局部胶原纤维过度增殖、细胞外基质异常超声基因转染仪UGT1025（重庆医科大学超声聚集形成增生性瘢痕一直是生物医学领域研究的热影像研究所，中国）;倒置荧光显微镜IX51（Olympus，点及难点之一。近年来出现了多种促伤口修复和治日本）;流式细胞仪FACSCalibur（BD，美国）;多功能疗瘢痕的方法，如手术切除皮瓣移植、点阵激光、局部酶标仪（PerkinElmerVictor3）（PerkinElmer，美国）;药物注射、放射治疗或综合疗法等，但上述方法多为Malvern激光粒径电位测量仪（马尔文帕纳科，中瘢痕形成后的治疗方式，不可避免对患者造成二次伤国）;激光共聚焦显微镜FV1200（Olympus，日本）;电害，难以彻底治愈。因此，亟需一种既能促进创面愈转仪DYCZ40（北京六一生物科技有限公司，中国）;合又能抑制增生性瘢痕形成的预防性治疗方式。促微量台式高速冷冻离心机ThermoScientificHeraeus血管新生的基因治疗为组织损伤创面修复提供了新Fresco21（上海珂淮仪器有限公司，中国）;紫外分光的治疗理念，正成为一种具有潜力的治疗策略。笔者光度仪CoulterDU730（Beckman，美国）。采用超声激励碱性成纤维细胞生长因子（basicfi-1.2方法broblastgrowthfactor，bFGF）微泡靶向治疗作为一种1.2.1携bFGF目的基因微泡制备与鉴定新型非病毒载体基因转导方式，一方面利用超声空化1.2.1.1bFGF质粒提取将含bFGF-EGFP菌液经效应促使血管基因bFGF大量表达;另一方面利用大肠杆菌扩增16h后提取纯化，应用凝胶电泳鉴定bFGF生物学效应，以期为组织损伤后提供细胞水平分析提取的bFGF-EGFP质粒;紫外分光光度计测定修复作用。1材料与方法1.1实验材料1.1.1主要试剂及材料含目的基因bFGF和标记基因增强型绿色荧光蛋白（enhancedgreenfluorescentprotein，EGFP）的质粒bFGF-EGFP（Invitrogen，美国）;bFGF抗体（Pro-teintech，美国）;十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶提取的bFGF-EGFP浓度。将该质粒进行扩增，使其质量浓度达到1mg/mL。1.2.1.2bFGF微泡的制备与鉴定首先采用磷脂混悬液（二硬脂酰磷脂酰胆碱、聚乙二醇二硬脂酰磷脂酰乙胺和3β-[N′-（N′，N′-二甲基胺乙基）胺基甲酰胺]胆固醇等）和PEI成功制备普通脂质微泡。调整微泡浓度至5×108/mL。通过自动计数仪检测所制备脂质微泡的平均粒径和浓度，将脂质微泡调整为（0.5~1.0）×108/mL。通过静电吸附法使带正电荷的脂质电泳（sodiumdodecylsulfate-polyacrylamidegelelec-微泡和带负电荷的质粒进行混匀结合。脂质微泡和trophoresis，SDS-PAGE）制备试剂盒、磷脂混悬液和bFGF-EGFP质粒按照体积比4∶1比例进行混合，即聚乙烯亚胺（polyethylenimine，PEI）（武汉谷歌生物4mL脂质微泡中加入1mLbFGF-EGFP质粒，使其科技有限公司，中国）;CCK8试剂（Dojindo，日本）;终质量浓度约0.2mg/mL，摇匀，室温静置30min备杜氏改良培养液（Dulbecco`smodifiedEaglemedium，用。同上，通过自动计数仪检测所制备bFGF-EGFPDMEM）（Gibco，美国）;4′，6-二脒基-2-苯基吲哚微泡的平均粒径和浓度，光学显微镜观察微泡的形态（4′，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）荧光染料（上和分布，通过Zeta电位仪分析带电荷情况。海碧云天生物技术研究所，中国）;逆转录聚合酶链1.2.2细胞培养式反应（reversetranscription-polymerasechainreac-成纤维细胞的分离与培养:取创伤周边组织约tion，RT-PCR）试剂盒（ThermoScientific，美国）;聚1cm×lcm大小，4℃保存，立即分离细胞;用磷酸盐偏二氟乙烯（polyvinylidenefluoride，PVDF）膜（Milli-缓冲溶液（phosphatebufferedsaline，PBS）清洗、分离，pore，美国）。血清培养液培养;待细胞生长密度达80%时，用PBS-266-生物医学工程与临床2021年5月第25卷第3期BME&ClinMed,May2021,Vol.25,No.3漂洗3次后加入含0.25%胰蛋白酶和0.02%乙二胺组，等量DMEM作为空白组;每孔中加入10μL四乙酸（ethylenediaminetetraaceticacid，EDTA）消CCK8，避光，于37℃、体积分数5%CO2培养箱孵育化，加入含10%胎牛血清的DMEM终止消化、传代、4h。用多功能酶标仪测量450nm波长的光密度备用。转染前24h用胰酶消化后接种于6孔板内，在（opticaldensity，OD）值，每组重复转染5次以上，取每体积分数5%CO2、37℃培养箱内培养，待每孔细胞生长至60%~70%左右融合时进行超声转染。组均值以减少随机误差。计算各组细胞存活率（%）=（OD转染组-OD空白组）/（OD对照组-OD空白组）×100%。1.2.3超声转染参数优化各组取500μL细胞悬液进行流式细胞仪检测参数优化标准:要求含bFGF质粒的转染效率相EGFP转染效率，计算细胞转染效率（转染效率=含对较高，同时又保持较高的细胞存活率（>80%）。最荧光的细胞比例×细胞存活率）。佳超声辐照条件筛选:向接种于6孔培养板的细胞混1.2.6目的基因bFGF转染后mRNA和蛋白相对表悬液内加入上述bFGF微泡进行转染。将探头置于距达量6孔板底部约3~5mm处进行照射。采用不同条件采用RT-PCR检测mRNA。转染48h后消化细（质粒质量浓度、声强、辐照时间和占空比）对培养的胞，提取RNA，合成cDNA，并以其为模板进行PCR扩细胞进行超声激励微泡转染。转染后采用CCK8法检增，检测bFGF、Ⅰ型和Ⅲ型胶原mRNA相对表达量。测细胞存活率;流式细胞仪检测各组细胞标记基因表采用Westernblot检测蛋白相对表达量。消化细达情况。为了优化超声微泡介导的转染参数，对实验胞、提取总蛋白、蛋白浓度测定、SDS-PAGE电泳、转条件进行了系列探索:膜、一抗、二抗孵育、信号放大、显影与曝光、扫描分（1）质粒质量浓度分别为5、10、15、20、25μg/mL。声强、辐照时间和占空比分别设定为1.00W/cm2、60s析，分别分析bFGF、Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白相对表达情况，均以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-和30%。phosphatedehydrogenase，GAPDH）作为参考。（2）声强分别为0.25、0.50、1.00、1.50、2.00W/cm2。1.3统计学方法质粒质量浓度、辐照时间和占空比分别设定为15μg/mL、采用SPSS20.0统计学软件进行分析。计量资料60s和30%。以均数±标准差表示，多组间参数比较采用单因素（3）辐照时间分别为30、45、60、120、180s。质粒方差分析;差异有统计学意义后，再采用SNK法行两浓度浓度、声强和占空比分别设定为15μg/mL、1.00W/cm2和30%。（4）占空比分别为10%、20%、30%、40%、50%。质粒质量浓度、声强和辐照时间分别设定为15μg/mL、1.00W/cm2和60s。两组间比较。P<0.05为差异有统计学意义。2结果2.1bFGF-EGFP质粒与微泡结合后的电位检测Malvern激光测量仪检测脂质纳米微泡的粒径大根据每组最优的细胞存活率和标记基因转染效小为（656.9±82.7）nm，Zeta电位大小约为（47.5±率所对应的超声参数作为后续实验最优的超声空化5.2）mV，该区间的微泡量占总微泡数的92.5%;测得效应条件。1.2.4超声转染携带bFGF-EGFP质粒纳米微泡粒径大小为（941.7±101.2）nm，Zeta电位大小约为（20.8±4.5）mV，该区实验分为4组，A组为对照组，B组为单纯间的微泡量占总微泡数的90.3%。bFGF-EGFP质粒组，C组为超声辐照+普通脂质微2.2成纤维细胞的超声转染参数优化泡组，D组为超声辐照+bFGF-EGFP微泡组。基因转染效率随质粒质量浓度增加而增加，当超声辐照条件采用前述研究确定的最佳条件。达到20μg/mL时转染效率达到峰值，但是当质粒转染前吸弃旧培养液，向每孔中加入2mLDMEM;转质量浓度进一步增加后转染效率并没有相应增加，染24h后在倒置荧光显微镜下观察各组EGFP表达情况，更换为内皮细胞培养液（endothelialcellmedi-um，ECM）继续培养。1.2.5细胞活性及转染效率且各组细胞存活率均较高（图1A）;当声强增加到1.50W/cm2时转染效率达到峰值，之后声强增加转染效率明显下降，细胞存活率也随之明显减低（图1B）。随着辐照时间逐渐增加到60s，基因表达效率转染48h后收集各组细胞，取90μL加入96孔达到最高，进一步增加辐照时间，基因表达效率因为板，并取正在培养未经转染的成纤维细胞作为对照细胞凋亡明显增多反而降低（图1C）。随着占空比从生物医学工程与临床2021年5月第25卷第3期BME&ClinMed,May2021,Vol.25,No.3-267-10%增加到40%，基因表达效率逐渐增高，进一步质粒质量浓度20μg/mL，声强1.50W/cm2，辐照时间增加占空比表达效率同样因为细胞死亡反而整体效60s，占空比40%。实验以这些优化参数进行转染基率降低（图1D）。因此实验研究中最优化超声参数为:因表达效率较高且细胞存活率高。图1不同质粒质量浓度（A）、声强（B）、辐照时间（C）、占空比（D）对细胞存活率和转染效率的影响曲线Fig.1Effectcurvesofdifferentplasmidconcentration(A),ultrasoundintensity(B),irradiationtime(C),dutycycle(D)oncellsurvivalrateandtransfectionefficiency2.34组表达标记基因绿色荧光蛋白比较2.44组细胞存活率和转染效率比较采用最优超声辐照参数进行转染时，A组和C组细胞转染48h后，4组细胞存活率均较高>80%，未见明显EGFP表达，仅偶尔发现极少量细胞自发荧且4组间差异均无统计学意义（P>0.05）。光。B组有少量EGFP表达，而D组EGFP表达量明A组和C组转染效率较低，分别为（5.2±1.6）%显增多。见图2。和（6.7±2.4）%;B组转染效率为（18.9±3.5）%，A组B组C组D组图24组表达标记基因EGFP情况（×100）ImagesofexpressionmarkerEGFPin4groups(×100)Fig.2-268-生物医学工程与临床2021年5月第25卷第3期BME&ClinMed,May2021,Vol.25,No.3D组转染效率为（60.0±7.9）%。D组较其他各组明显增加，差异有统计学意义（tAD=21.499，P=0.000;tBD=20.414，P=0.000;tCD=15.042，P=0.000）。见图3。A组150120906030M10100101102强度103104C组150120906030M1数计胞细数计胞细B组150120906030M10100101102强度103104D组150120906030M1数计胞细数计胞细0100101102强度1031040100101102强度103104图34组转染效率流式直方图Fig.3Flowhistogramoftransfectionefficiencyin4groups2.5超声激励目的基因bFGF转染后mRNA和蛋组减少，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表1和白相对表达量图4A。转染48h后，bFGFmRNA在B组和D组明显bFGF、Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白表达整体趋势同增加，其中D组增加最显著，差异均有统计学意义mRNA，均表现为D组bFGF蛋白增加，Ⅰ型和Ⅲ型（P<0.05）;而Ⅰ型胶原mRNA和Ⅲ型胶原mRNA胶原蛋白减少，差异均有统计学意义（P<0.05）。见则表现为相反的趋势，即A组和C组较多，B组和D表1和图4B。Tab.1RelativeexpressionlevelsofmRNAandproteinafterultrasoundstimulatedtransfectionin4groups表14组超声激励转染后mRNA和蛋白相对表达量%%项目A组B组C组D组bFGF12.1±1.020.0±3.5▲10.1±2.9△mRNAⅠ型胶原38.3±4.320.2±3.3▲38.7±5.2△Ⅲ型胶原40.4±5.230.5±4.1▲40.5±5.7△bFGF8.1±2.016.4±4.0▲9.3±3.1△蛋白Ⅰ型胶原29.2±5.115.3±3.1▲30.5±5.0△Ⅲ型胶原30.3±6.220.4±4.0▲30.6±5.4△45.0±5.1▲△#15.8±2.6▲△#20.7±3.1▲△#35.0±5.0▲△#9.1±3.0▲△#11.2±3.1▲△#与A组相比，tB组分别为6.9、10.6、4.7、5.9、7.4、4.2，tD组分别为20.0、14.2、10.3、15.8、10.7、8.7，▲P<0.05;与B组相比，tC组分别为6.9、9.5、4.5、4.4、8.2、4.8，tD组分别为12.8、3.3、6.0、9.2、4.5、5.7，△P<0.05;与C组比较，tD组分别为18.8、12.5、9.6、13.8、11.6、9.9，#P<0.053讨论面修复需要1个月甚至更长时间，期间如果并发感染则甚至迁延不愈或形成大量增生性瘢痕，修复时间更严重的皮肤烧烫伤、切割伤和撕裂伤后，组织创加延长。因此如何促进创伤后组织尽快愈合，并防止生物医学工程与临床2021年5月第25卷第3期BME&ClinMed,May2021,Vol.25,No.3AbFGFmRNA468bpBbFGFCollageⅠmRNA332bpCollageⅠCollageⅢmRNA254bpCollageⅢGAPDH199bpGAPDH-269-1800013000016000037000图4超声激励目的基因bFGF转染后mRNA（A）和蛋白（B）相对表达量电泳条带图Fig.4ElectrophoresismapsofrelativeexpressionlevelsofmRNA(A)andprotein(B)aftertransfectionoftargetgenebFGFstimulatedbyultrasound局部胶原纤维过度增殖、细胞外基质异常聚集形成增growthfactor1，IGF-1）、转化生长因子β（transforming生性瘢痕一直是生物医学领域研究的热点及难点之growthfactor-β，TGF-β）和bFGF等在组织损伤时表一。现阶段治疗方式总疗程长，有的会对患者造成二次疼痛伤害，难以彻底治愈，长期治疗过程中部分患达量增加，尤其是bFGF在多种组织损伤中均具有加速愈合作用[8]。一方面可以刺激成纤维细胞和细胞外者甚至出现心理障碍，且不利于促进创面修复，缺乏基质达到动态平衡;另一方面通过促进成纤维细胞在瘢痕形成前的有效预防性措施。因此，亟需一种能产生胶原酶、刺激毛细血管内皮细胞增殖来诱导新既促进创面愈合又能抑制增生性瘢痕形成的预防性生血管形成，因此在各种组织损伤中具有重要修复功治疗方式。能[3，10~12]。笔者研究中bFGF基因表达后明显抑制Ⅰ非病毒载体促血管新生的基因治疗为组织损伤型和Ⅲ型胶原的生成。与既往研究结果一致，均表现创面修复提供了新的治疗理念，正成为一种具有潜力为bFGF降低创伤组织中Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白表达的治疗策略。这种治疗方法是向创伤部位导入含细胞量，从而进一步减少细胞外基质合成和沉积，从而加生长因子基因，诱导组织损伤部位新生血管形成[1~3]。速创面愈合，减少瘢痕形成[11~13]。因此，bFGF既能诱因此，如何使治疗基因在创伤组织持续、稳定、高效表导新生毛细血管形成，又能抑制成纤维细胞异常增达以获得足够的血管新生效应是其治疗的关键[4]。超殖，减少胶原蛋白的产生，抑制增生性瘢痕形成，在组声激励微泡作为一种新型非病毒载体基因转导方式，织修复中具有重要作用[6~8]。避免了病毒载体的潜在毒性和免疫原性，主要是利用尽管bFGF作用如此关键，但是其存在半衰期微泡空化效应产生的致声孔作用使细胞膜表面出现短、扩散快，容易被蛋白酶分解等缺点，且作为生物大可逆性微孔，细胞通透性及组织间隙增加。这样外源分子物质bFGF缺乏高效、安全、可控的靶向药物递性DNA通过细胞膜屏障进入细胞内能高效、稳定促进目的基因表达[5~7]。目前利用超声空化效应和热效应等物理特性促进损伤组织修复，已经在骨、软骨、神送系统，从而限制了其广泛应用。如何在有效时间内使足够bFGF到达靶组织细胞也是研究的重点和难点之一[8]。采用传统给药方式效果不明显，而利用超经组织修复等方面取得成功[6~9]，为研究靶向促进皮声促进基因修复的方式可以发挥持续、稳定、高效表肤组织修复提供强有力的技术支持。笔者研究中在细达bFGF的作用[14~16]，刚好可以弥补bFGF的不足之胞水平各组超声转染后细胞活性均较高（>80%），证实了该治疗方式具备安全可行性;且超声激励处。超声控制给药的方式一方面明显提升bFGF的生物学效果[12]，另一方面比导管复合物给药等方式更佳bFGF微泡组转染效率较其他组明显提高，证实了该便捷[17]。超声激励微泡bFGF基因转染技术的组合应方式具备有效性。用是物理学和生物学的交叉结合，能更好地发挥bFGF为一种146个氨基酸组成的多肽，是目前bFGF对创伤组织生理结构和生物功能的保护作用，已知较强的促细胞生成因子。许多学者研究证实，多为皮肤创伤组织修复提供一种交叉学科安全、高效的种细胞因子如胰岛素样生长因子1（insulin-like技术策略[18~20]。-270-生物医学工程与临床2021年5月第25卷第3期BME&ClinMed,May2021,Vol.25,No.3总之，笔者研究是基于超声激励微泡靶向治疗的究[J].重庆医学，2017，46（13）:1747-1749.]优势和bFGF的生物学特征，应用携bFGF基因的微泡，结合超声空化效应在细胞水平增强bFGF基因转染效率，促进细胞因子大量表达，加速组织修复，抑制胶原蛋白表达量，改善微环境，以期能抑制瘢痕增生。这种兼具超声物理学效应和细胞因子生物学特征的双重交叉作用方式，将对下一步动物在体修复抑制增[10]ZbindenA,BrowneS,AltiokEI,etal.Multivalentconju-gatesofbasicfibroblastgrowthfactorenhanceinvitropro-liferationandmigrationofendothelialcells[J].BiomaterSci,2018,6(5):1076-1083.[11]KoikeY,YozakiM,UtaniA,etal.Fibroblastgrowthfactor2acceleratestheepithelial-mesenchymaltransitioninker-atinocytesduringwoundhealingprocess[J].SciRep,2020,10生性瘢痕产生积极影响。(1):18545-18545.参考文献:[12]RippaAL,KalabushevaEP,VorotelyakEA.Regenerationofdermis:scarringandcellsinvolved[J].Cells,2019,8(6):607-[1]TienJ.Tissueengineeringofthemicrovasculature[J].Compr607.Physiol,2019,9(3):1155-1212.[13]XieJL,BianHN,QiSH,etal.Basicfibroblastgrowthfactor[2]KoduruSV,LeberfingerAN,PasicD,etal.Cellularbased(bFGF)alleviatesthescaroftherabbitearmodelinwoundstrategiesformicrovascularengineering[J].StemCellRevRep,healing[J].WoundRepairRegen,2008,16(4):576-581.2019,15(2):218-240.[14]LuX,JinH,QuesadaC,etal.Spatially-directedcellmigra-[3]FujiharaY,KoyamaH,OhbaM,etal.Controlleddeliveryoftioninacoustically-responsivescaffoldsthroughthecon-bFGFtorecipientbedenhancesthevascularizationandvia-trolleddeliveryofbasicfibroblastgrowthfactor[J].ActaBio-bilityofanischemicskinflap[J].WoundRepairRegen,2008,mater,2020,113:217-227.16(1):125-131.[15]DongX,LuX,KingstonK,etal.Controlleddeliveryofbasic[4]YangJ,QiangW,RenS,etal.High-efficiencyproductionoffibroblastgrowthfactor(bFGF)usingacousticdropletvapor-bioactiveoleosin-basicfibroblastgrowthfactorinA.thalianaizationstimulatesendothelialnetworkformation[J].ActaBio-andevaluationofwoundhealing[J].Gene,2018,639:69-76.mater,2019,97:409-419.[5]ZhaoYZ,TianXQ,ZhangM,etal.Functionalandpatholog-[16]ToledoRN,BorinA,CruzOLM,etal.Theactionoftopicalicalimprovementsoftheheartsindiabetesmodelbythebasicfibroblastgrowthfactorinfacialnerveregeneration[J].combinedtherapyofbFGF-loadednanoparticleswithultra-OtolNeurotol,2010,31(3):498-505.sound-targetedmicrobubbledestruction[J].JControlRelease,[17]MaF,XiaoZ,ChenB,etal.Linearorderedcollagenscaffold2014,186:22-31.loadedwithcollagenbindingbasicfibroblastgrowthfactor[6]DriverVR,YaoM,MillerCJ.Noncontactlow-frequencyul-facilitaterecoveryofsciaticnerveinjuryinrats[J].TissueEngtrasoundtherapyinthetreatmentofchronicwounds:APartA,2014,20(7-8):1253-1262.meta-analysis[J].WoundRepairRegen,2011,19(4):475-480.[18]ZhaoYZ,LiX,LuCT,etal.Gelatinnanostructuredlipid[7]MoncionA,LinM,O'NeillEG,etal.Controlledreleaseofcarriers-mediatedintranasaldeliveryofbasicfibroblastbasicfibroblastgrowthfactorforangiogenesisusingacousti-growthfactorenhancesfunctionalrecoveryinhemiparkinso-cally-responsivescaffolds[J].Biomaterials,2017,140:26-36.nianrats[J].Nanomedicine,2014,10(4):755-764.[8]SHENYu-zhou.PreparationofbFGFgenetargetedacoustic[19]XuHL,ChenPP,ZhuGeDL,etal.Liposomeswithsilkfi-microbubblesanditspreventionofadhesionafterachillesbroinhydrogelcoretostabilizebFGFandpromotethetendoninjurysurgery[D].Shant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