c(RGDyk)环肽修饰纳米胶束逆转脑胶质瘤对多西他赛的耐药性
【摘要】 目的:构建c(RGDyk)环肽修饰的纳米胶束包载多西他赛（DTX），体外评价其逆转人脑胶质瘤U87细胞对DTX耐药性。方法:以泊洛沙姆-188（PL-188）为原材料，经琥珀酸酐羧基化后，键合c(RGDyk)环肽，合成c(RGDyk)-PL-188靶向材料并进行结构确证;c(RGDyk)-PL-188为包裹材料，利用纳米共沉淀法制备载DTX的纳米胶束[c(RGDyk)DTX-NPs]并进行处方优化筛选;透射电镜（TEM）、差示扫描量热法（DSC）以及动态透析法对c(RGDyk)DTX-NPs形态、药物晶型和体外药物释放行为进行详细表征;体外CCK8细胞存活率检测、细胞摄取以及肿瘤球生长抑制，评价c(RGDyk)DTX-NPs对DTX耐药的人脑胶质瘤U87细胞逆转效果。结果:1H-NMR和FT-IR表明成功合成c(RGDyk)-PL-188材料，该材料能自发组装成粒径为115.6nm的胶束;c(RGDyk)-PL-188/DTX质量比10:1时，该胶束对DTX载药量可达7.88%±0.02%，包封率高达85.50%±2.78%，粒径稍增大，为（159.2±0.2）nm，Zeta电位为（-19.2±0.4）mV，TEM显示具有球形微观结构;体外释放表明c(RGDyk)DTX-NPs展现缓释释放行为，48h内DTX累积释放仅为78%;细胞摄取表明c(RGDyk)-NPs能特异靶向耐药的人脑胶质瘤U87细胞，显著提高荧光探针ICG在细胞内荧光分布，其靶向性被游离c(RGDyk)竞争抑制;与DTX溶液和DTX-NPs相比，c(RGDyk)DTX-NPs对DTX耐药的人脑胶质瘤U87细胞具有更强的细胞毒性;体外U87人脑胶质瘤细胞球模型研究表明c(RGDyk)DTX-NPs能更有效渗透至肿瘤球深部，抑制肿瘤球生长。结论:c(RGDyk)环肽修饰纳米胶束能有效装载DTX，具有较高的载药量和包封率，能特异性靶向人脑胶质瘤U87细胞，逆转其对DTX的耐药性。[关键词]多西他赛;胶束;泊洛沙姆;神经胶质瘤;细胞球;多药耐药[中图分类号]R94DOI:10.3969/j.issn.2095-9400.2019.11.001Thereversingeffectofc(RGDyk)modifiedNano-micellesonthedocetaxel-resistanceofgliomaWUQilong1,CAIJinhua1,XUHelin2,LIHui1,ZHAOYingzheng2,CHENBin1.1.DepartmentofUltrasonography,theFirstAffiliatedHospitalofWenzhouMedicalUniversity,Wenzhou325015,China;2.SchoolofPharmaceuticalSciences,WenzhouMedicalUniversity,Wenzhou325035,ChinaAbstract:Objective:Topreparec(RGDyk)cyclicpeptidemodifiedNano-micellesencapsulatingdocetaxel(DTX)andtoevaluateitsabilitytoreversetheresistanceofU87gliomacellsagainstDTX.Methods:UsingPoloxamer188(PL-188)asrawmaterial,aftercarboxylationofsuccinicanhydride,thec(RGDyk)cyclicpeptidewasbondedtosynthesizec(RGDyk)-PL-188targetingmaterialanditsstructurewasconfirmedby1H-NMRandFT-IR.c(RGDyk)-PL-188wasusedasthecoatingmaterial;theNano-micellesencapsulatingDTX[c(RGDyk)DTX-NPs]werepreparedbyNanocoprecipitationmethodandtheprescriptionwasoptimized.Trans-missionelectronmicroscope(TEM),differentialscanningcalorimetry(DSC)anddynamicdialysismethodwereusedtocharacterizethemorphology,drugcrystalformanddrugreleasebehaviorofc(RGDyk)DTX-NPsinvitro.CCK8cellularviabilityassayinvitro,cellularuptakeandU87cellsspheroidsgrowthinhibitiontestwereappliedtoevaluatethereversaleffectofc(RGDyk)DTX-NPsonhumangliomaU87cellsresistancetoDTX.Results:1H-NMRandFT-IRshowedthatc(RGDyk)-PL-188wassuccessfullysynthesized,whichcouldbespontane-本文引用:吴其隆,蔡锦华,徐荷林,等.c(RGDyk)环肽修饰纳米胶束逆转脑胶质瘤对多西他赛的耐药性[J].温州医科大学学报,2019,49(11):781-790.·论 著·-782-第49卷温州医科大学学报第11期成胶束的能力以及其对DTX的包载性能，评价其对耐药的人脑胶质瘤U87细胞的靶向性与抗肿瘤效果。1材料和仪器1.1材料DTX购自上海龙翔生物医药开发有限公司;N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）、1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDC）购自上海阿拉丁公司;2-（2-甲氧基-4-硝苯基）-3-（4-硝苯基）-5-（2，4-二磺基苯）-2H-四唑单钠盐（CCK8）购自日本株式会社同仁化学研究所;c(RGDyk)环状短肽购自上海吉尔生化有限公司;C6细胞购自中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所;耐DTX的人脑胶质瘤U87细胞购自北京NTCC典型培养物保藏中心;DMEM培养基、RPMI1640培养液、胰酶、胎牛血清购自美国Gibco公司;PL-188、DAPI试剂盒购自美国Sigma公司。1.2仪器FD-1C冷冻干燥机（北京德天佑有限公司），JEM-2100F透射电子显微镜（日本电子株式会社），SpectraMaxM3酶标仪（美国MolecularDevices公司），马尔文纳米粒度电位仪ZetasizerNanoZSP（英国Malvern公司），DSC差示扫描量热仪（瑞士MettlerToledo公司），Nikon正置荧光显微镜、Nikon倒置荧光显微镜（日本Nikon公司）。2方法2.1c(RGDyk)-PL-188聚合物的合成与结构确证两步法合成c(RGDyk)-PL-188聚合物:首先，合成羧基化PL-188，称取9gPL-188、0.54g琥珀酸多西他赛（docetaxel，DTX）是由欧洲浆果紫杉的针叶中提取的化合物半合成的紫杉醇衍生物。其作用机制是通过促进微管双聚体装配成微管，并且防止去多聚化过程而使微管稳定，阻滞细胞于G2和M期，抑制细胞的进一步分裂，从而抑制癌细胞的有丝分裂和增殖[1-2]。其对于乳腺癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、黑色素瘤、胃癌、胰腺癌、软组织肉瘤均具有一定疗效[3]。然而DTX存在水溶性差、脂溶性不强、体内循环时间短以及耐药性等缺点，限制了其在临床上的广泛应用。目前临床上使用的DTX注射液是添加了非离子表面活性剂，如乙醇和聚山梨酯80（吐温80），而这些表面活性剂容易导致骨髓抑制、过敏反应、神经毒性以及溶血等不良反应[4-5]。为了克服以上不足，已有报道将DTX制成脂质体、纳米粒、水凝胶、聚合物胶束等用于疾病的诊断和治疗[6-9]。本研究以泊洛沙姆188（PL-188）为纳米材料，因其在结构上是一种三嵌段的聚氧乙烯和聚氧丙烯共聚物（PEO-PPO-PEO），以中间的PO链为疏水嵌段，两端的EO链为亲水嵌段，该聚合物能自发组成纳米胶束。同时，已有报道证实泊洛沙姆可以逆转多种类型肿瘤的耐药性，使一线化疗药物对耐药肿瘤细胞的毒性增加2-3倍[10-11]。环状c(RGDyk)短肽作为细胞整合素及其配体相互作用的识别位点，能与C6脑胶质瘤细胞以及人脑胶质瘤U87耐药细胞上过表达的整合素αvβ3特异性结合[12-13]，提高化疗药物对肿瘤细胞的杀伤毒性。本实验以PL-188为原材料制备羧基化PL-188，将c(RGDyk)与其键合，构建c(RGDyk)-PL-188靶向新材料。探索c(RGDyk)-PL-188自组装形ouslyassembledintomicelleswithmeanparticlediameterof(115.6±0.2)nm.Whenthemassratioofc(RGDyk)-PL-188/DTXis10:1,drugloadingcontentanddrugloadingefficiencyforDTX-loadedmicelleswerehighupto7.88%±0.02%and85.5%±2.78%,respectively.DTX-loadedmicelleshadameandiameterof(159.2±0.2)nmandzetapotentialof(-16.8±0.8)mV,exhibitingthesphericalshapedeterminedbyTEM.InvitroDTXreleaseshowedthatc(RGDyk)DTX-NPsexhibitedsustained-releasebehaviorandthecumulativereleaseofDTXwasonly78%within24hours.Cellularuptakeindicatedthatc(RGDyk)-NPscouldspecificallytargetdrug-resistanthumangliomaU87cells,whichsignificantlyincreasedtheintracellularfluorescencedistributionoffluorescentprobeICG,anditstargetabilitywasinhibitedbyfreec(RGDyk)solution.ComparedwithDTXsolutionandDTX-NPs,c(RGDyk)DTX-NPshadthestrongercytotoxicitytodrug-resistanthumangliomaU87cells.ThestudyofU87humangliomacellsspheroidsmodelinvitroshowedthatc(RGDyk)DTX-NPscouldpenetrateintothedeeppartofthetumorspheroidsmoreeffectivelyandinhibitthegrowthofthetumorspheroids.Conclusion:DTXisefficientlyencapsulatedinc(RGDyk)cyclicpeptidemodifiedNano-micelleswithhighdrugloadingcontentanddrugloadingefficiency,specificallytargetingU87humangliomacellsandreversingtheirresistanceagainstdocetaxel.Keywords:docetaxel;micelles;poloxamer;glioma;cellsspheroids;multi-drugsresistance-783-第11期第49卷酐、0.27g4-二甲基氨基吡啶并量取0.5mL三乙胺共溶于30mL1，4-二恶烷中，磁力搅拌使其完全溶解并在室温下搅拌24h。将混匀后的液体加入至透析袋内（透析膜截留相对分子质量为3500Da），用蒸馏水透析72h，前24h每隔6h换水1次，后48h每隔12h换水1次，以除去混合液中的有机溶剂，冻干获得羧基化PL-188（CT-P188）粉末;其次，合成c(RGDyk)-PL-188聚合物，称取0.1g吗啉乙磺酸（MES）溶解在10mL蒸馏水中并搅拌10min，向溶液中加入0.4gEDC和0.2gNHS搅拌直至完全溶解，加入0.3g羧基化PL-188和0.02gc(RGDyk)于室温下磁力搅拌24h，经透析和冻干获得c(RGDyk)-PL-188聚合物粉末。利用FT-IR和1H-NMR对羧基化PL-188和c(RGDyk)-PL-188聚合物进行结构确证。FT-IR分析以KBr粉末压片制样，KBr空白片扣除背景，扫描范围4000~800cm-1。分辨率为4cm-1，谱峰读数精度为0.01cm-1。1H-NMR分析在BrukerAV-600核磁共振仪上完成，所有样品经过DMSO-d6处理。2.2c(RGDyk)DTX-NPs的制备与筛选采用纳米沉淀法制备载DTX的靶向纳米胶束[c(RGDyk)DTX-NPs]，称取100mgc(RGDyk)-PL-188和一定量的DTX，溶于3mL乙腈中，磁力搅拌使其完全溶解，作为有机相;在剧烈搅拌下，将5mL蒸馏水缓慢滴入有机相中（约30min）并继续搅拌30min使其混合均匀。将混匀后的液体加入至透析袋内（透析膜截留相对分子质量为3500Da），用蒸馏水透析24h，开始每隔2h换水1次，后每9h换水1次以除去混合液中的有机溶剂，5000r/min离心除去药物沉淀，获得上清液，即为载DTX纳米胶束c(RGDyk)DTX-NPs。固定材料每次用量为100mg，选取不同总投药量（2、5、10、20mg），以考察最大的载药量和包封率。同样，称取100mgPL-188和上述优化后的DTX投药量按照相同的方法制备DTX-NPs作为后续实验的对照组。2.3载药量及包封率的测定高效液相色谱法（HPLC）测定药物载药量和包封率，量取500μLc(RGDyk)DTX-NPs至5mL容量瓶中，加入乙腈，超声波破坏胶束，乙腈定容至刻度，0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液，进样量为20μL，采用Agilent1200高效液相色谱仪测定。HPLC条件:XTerraRP18色谱柱（250mm×4.6mm，5μm）;流动相:乙腈/水（47:53，v/v）;流速1.0mL/min，检测波长为230nm，柱温25℃。通过以下公式计算载药量及包封率。2.4c(RGDyk)DTX-NPs的表征动态光散射激光粒度测定仪（dynamiclightscattering，DLS）对空白纳米胶束，c(RGDyk)DTX-NPs进行粒径和Zeta电位的测定。纳米胶束水溶液过0.45μm膜以除去灰尘，经过适当稀释后，于常温条件下固定激光波长为632.8nm，散射角为90°测定其粒径以及Zeta电位。透射电镜（transmissionelectronmicroscope，TEM）检测纳米胶束形态，取空白纳米胶束或载药纳米胶束滴于铺有碳膜的铜网上，以无纤维滤纸从铜网边缘吸掉多余液体，滴入2%磷钨酸染色，自然晾干2d，置于TEM中以200kV加速电压检视、拍照。差示扫描量热法（differentialscanningcalorimetry，DSC）分析纳米胶束内药物分散状态，取适量c(RGDyk)DTX-NPs冻干样品进行DSC分析，起始温度为0℃，升温速度为5℃/min，终止温度为250℃。c(RGDyk)-PL-188材料、DTX粉末、c(RGDyk)-PL-188和DTX的物理混合物同法测定，对照比较确定药物分散状态。2.5c(RGDyk)DTX-NPs稳定性为了考察c(RGDyk)DTX-NPs的粒径与载药稳定性，c(RGDyk)DTX-NPs置于pH7.4PBS溶液和含有胎牛血清白蛋白（BSA）的pH7.4PBS中于37℃环境中振摇孵育不同时间，3000r/min离心5min，取上清液适量按照2.3和2.4所述方法分别测定c(RGDyk)DTX-NPs的药物浓度和粒径。2.6c(RGDyk)DTX-NPs体外药物释放采用动态透析法对游离DTX溶液以及c(RGDyk)DTX-NPs的体外释药行为，取1mLc(RGDyk)DTX-NPs加入至透析袋内（透析膜截留相对分子质量为3500Da），扎紧并密封两端，放置在含有0.5%吐温-80的50mLpH7.4PBS介质中，置水浴摇床于37℃，120r/min震摇，分别于2、4、6、8、10、12、24h取1mL释放介质，并补充1mL相应的新鲜释放介质，按照2.3所述的HPLC方法进行检测，计算累积释放百分数，绘制释放曲线。2.7二维胶质瘤细胞模型评价2.7.1胶质瘤细胞的培养:以C6胶质瘤和耐DTX的人脑胶质瘤U87细胞株为模型，考察c(RGDyk)DTX-载药量（%）=测得药物的质量×100%（公式一）测得药物的质量+聚合物质量包封率（%）=测得药物的质量×100%（公式二）制备时加入药物量吴其隆，等:c(RGDyk)环肽修饰纳米胶束逆转脑胶质瘤对多西他赛的耐药性-784-第49卷温州医科大学学报第11期NPs体外抗肿瘤效果。C6细胞培养条件为:使用含有10%胎牛血清的高糖DMEM培养基于温度为37℃、CO2浓度为5%的细胞培养箱中培养。耐DTX的人脑胶质瘤U87细胞株培养条件为:使用含有10%胎牛血清的RPMI1640培养基加入1μg/mLDTX以维持细胞耐药性，于实验2周前停药，培养温度为37℃、CO2浓度为5%。待培养皿中细胞融合率达85%，使用含有0.25%EDTA的胰酶至培养皿中消化，对其进行传代培养。2.7.2CCK8法细胞毒性实验:CCK8试剂盒检测C6胶质瘤和耐DTX的人脑胶质瘤U87细胞株经不同浓度的DTX溶液、DTX-NPs、c(RGDyk)DTX-NPs处理后的细胞活性。将对数生长期的细胞消化后，用培养基稀释至5×103个/mL细胞密度，经过吹打后，以100μL/每孔将细胞悬液接种在96孔板内，将96孔板置于细胞培养箱中培养24h使细胞贴壁。待贴壁后，每孔加入100μL上述不同浓度的不同药物的新鲜培养介质，并设置一不做任何处理的空白对照组。继续培养48h后，将96孔板取出，吸出所有培养基，用PBS清洗1次，每孔加入90μL新鲜培养基和10μLCCK8的混合液，于培养箱中继续培养2h，使用SpectraMaxM3酶标仪测定450nm处的吸光度。按照如下公式计算细胞的存活率（%）。A加药:具有细胞、CCK溶液和药物溶液的孔的吸光度;A空白:具有培养基和CCK溶液而没有细胞的孔的吸光度;A0加药:具有细胞、CCK溶液而没有药物溶液的孔的吸光度。2.7.3c(RGDyk)DTX-NPs细胞靶向性评价:为了观察c(RGDyk)DTX-NPs对耐DTX的人脑胶质瘤U87细胞的靶向性，以荧光探针吲哚菁绿（ICG）代替DTX制备荧光标记的c(RGDyk)ICG-NPs。耐DTX的人脑胶质瘤U87细胞株以1×105个/mL密度接种于含有载玻片的6孔板中，置于细胞培养箱中培养24h贴壁后，移去培养液，加入ICG-NPs、c(RGDyk)ICG-NPs，置于细胞培养箱中继续培养2h，移去含药细胞培养液，加入4℃1mLPBS终止细胞摄取，并冲洗细胞3次，每次5min。加入4%多聚甲醛于4℃环境下固定细胞20min，吸出固定液，继续用1mLPBS冲洗细胞3次，每次5min。加入0.5%曲拉通（Triton）于室温下通透细胞15min，PBS冲洗3次，加入含有DAPI染液（1mg/mL）的抗荧光猝灭剂，封片后于正置荧光显微镜下观察细胞摄取情况。另外，耐DTX的人脑胶质瘤U87细胞先经c(RGDyk)封闭，后加入c(RGDyk)ICG-NPs孵育2h后，确定细胞内荧光分布变化，进一步确证其靶向性。2.8脑胶质瘤细胞球评价2.8.1c(RGDyk)ICG-NPs对脑胶质瘤肿瘤球生长抑制:取对数生长期的DTX耐药人脑胶质瘤U87细胞，0.25%胰酶消化后吹打成单细胞悬液，用无血清培养基、含链霉素100μg/mL、青霉素100U/mL、bFGF20ng/mL、EGF20ng/mL以及B27添加物（1×）的DMEM/F12培养液对细胞进行重悬，以每孔1×104个细胞的浓度分别接种于低吸附塑料48孔板，并置于温度为37℃、CO2浓度为5%的细胞培养箱中培养，根据细胞生长的速度以及培养液的颜色变化更换培养液。选择大小均匀、圆整致密的肿瘤球，分别加入DTX溶液（10μg/mL）、c(RGDyk)DTX-NPs（相当于10μg/mLDTX）对肿瘤球进行处理，并以PBS溶液处理的肿瘤球作为对照组。于3、6、10d后于倒置显微镜下观察U87胶质瘤肿瘤球的体积变化。2.8.2c(RGDyk)ICG-NPs对脑胶质瘤细胞球渗透性:按照2.8.1方法培养DTX耐药的人胶质瘤U87细胞球，7d后于显微镜下观察细胞球的形态与大小，取大小均匀，圆整致密的细胞球进行如下实验。每孔加入ICG-NP或c(RGDyk)ICG-NPs，于37℃培养箱孵育24h，孵育完毕后移除培养液，用4℃PBS冲洗3次，4%多聚甲醛固定30min，PBS再次冲洗3次，置于载玻片上，抗荧光猝灭剂封片后通过激光共聚焦显微镜断层扫描并拍照，观察c(RGDyk)ICG-NPs对脑胶质瘤细胞球渗透深度。2.9统计学处理方法采用SPSS22.0统计软件进行分析。计量资料以±s表示，两两比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。3结果与讨论3.1c(RGDyk)-PL-188聚合物合成和结构确证c(RGDyk)-PL-188聚合物经两步法合成，首先以PL-188为原材料经琥珀酸酐羧基化后，合成制备得到CT-P188;CT-P188端羧基经EDC/NHS活化后与c(RGDyk)环肽的氨基缩合，合成制备得到c(RGDyk)-PL-188靶向材料。FT-IR和1H-NMR对CT-P188和c(RGDyk)-PL-188结构进行确证，结果如图1。相比PL-188的FT-IR谱图（见图1A），CT-P188的FT-IR结果细胞存活率（%）=A加药-A空白×100%（公式三）A0加药-A空白-785-第11期第49卷除了出现PL-188骨架相关峰如3300cm-1（OH伸缩振动），2852cm-1（CH2伸缩振动）以及1100cm-1（C-O-C伸缩振动），还出现了COOH相关的特征峰如1735cm-1（C=O伸缩振动）。相比之下，c(RGDyk)-PL-188的FT-IR结果除了出现CT-P188相关峰外，还出现了c(RGDyk)相关的特征峰如1650cm-1（酰胺I带）和1580cm-1（酰胺II带）。相似，CT-P188的1H-NMR图谱（见图1B）除了出现PL-188骨架相关峰如3.5ppm（-OCH2CH2O-）以及1.3ppm（-OCH2CH2CH2O-）外，还出现了琥珀酸相关特征峰如2.5ppm（O=C-CH2CH2-C=O）。相比之下，c(RGDyk)-PL-188的1H-NMR图谱出现了c(RGDyk)相关峰如2.5~3.2ppm峰。A:FT-IR;B:1H-NMR图1c(RGDyk)-PL-188聚合物结构表征3.2c(RGDyk)DTX-NPs的制备与处方筛选c(RGDyk)-PL-188聚合物和DTX共溶于DMSO，在搅拌下滴入蒸馏水，自发纳米沉淀自组装，制备载DTX的纳米胶束[c(RGDyk)DTX-NPs]。控制制备过程中所用DMSO体积，聚合物投料以及搅拌速度等因素，改变处方中c(RGDyk)-PL-188聚合物/DTX比例，制备系列c(RGDyk)DTX-NPs。通过测定各配方下制备的纳米胶束载药量、包封率、粒径和PDI、电位等指标，筛选出最适处方。结果如表1所示，随着c(RGDyk)-PL-188/DTX质量比从50:1升高至10:1，纳米胶束中DTX的载药量逐渐增大，而包封率则逐渐降低，粒径稍有增大。但当c(RGDyk)-PL-188/DTX增加至5:1时，纳米胶束中DTX的载药量反而降低，包封率则仅有22.6%，表明由于在该条件下药物的超饱和状态诱导快速药物析出晶型不利于胶束包载。综上分析，当c(RGDyk)-PL-188/DTX质量比为10:1时，所制备纳米胶束具有较高的载药量（7.88%±0.02%）和适当的包封率（85.5%±2.78%），其粒径（159.2nm）相比空白胶束（115.6nm）虽稍有增大，但仍小于200nm，而且其具有较窄的粒径分布（PDI=0.12）。因此，后续载DTX的纳米胶束的稳定性、体外释放以及细胞实验均以该处方进行研究。表1不同聚合物和药物投料质量比对纳米胶束载药量、包封率、平均粒径、PDI、Zeta电位的影响（n=3）c(RGDyk)-PL-188/DTX质量比载药量（%）包封率（%）平均粒径（nm）PDIZeta电位（mV）50:11.92±0.0697.9±4.36128.4±0.20.11±0.03-18.3±0.120:14.36±0.0591.2±3.65145.9±0.10.11±0.02-18.9±0.210:17.88±0.0285.5±2.78159.2±0.20.12±0.02-19.2±0.45:14.33±0.0522.6±4.09172.1±0.30.16±0.6-17.1±0.23.3c(RGDyk)DTX-NPs的粒径与形态分别以DLS和TEM检测c(RGDyk)DTX-NPs水化粒径（Dh）、粒位分散指数（polymeydisperseindex，PDI）和形态。粒径分布结果如图2A、2B所示。相比空白c(RGDyk)-PL-188纳米胶束[Dh=（115.6±0.2）nm，PDI=0.11]，c(RGDyk)DTX-NPs水化粒径稍有增大，Dh为（159.2±0.2）nm，粒径分布稍有变宽（PDI=0.12），表明药物装载在胶束核内。胶束样品经2%磷钨酸负染后，通过TEM观察c(RGDyk)-PL-188和c(RGDyk)DTX-NPs微观形态。结果如图2C、2D，c(RGDyk)-PL-188和c(RGDyk)DTX-NPs纳米胶束均呈白色的球形粒子并且分布均匀，TEM测量的c(RGDyk)-PL-188脱水状态下粒径为55nm，而c(RGDyk)DTX-NPs脱水粒径则增大至65nm，二者均显著小于DLS测量的水化粒径。吴其隆，等:c(RGDyk)环肽修饰纳米胶束逆转脑胶质瘤对多西他赛的耐药性c(RGDyk)-PL-188BACT-P188PL-1888.57.56.55.54.53.5fl(ppm)2.51.50.5c(RGDyk)c(RGDyk)-PL-188CT-P188PL-18880016002400320040000102030405060708090100Wavelength(cm-1)Transmittance(%)c(RGDyk)-786-第49卷温州医科大学学报第11期这表明c(RGDyk)-PL-188材料自组装的胶束外壳由致密的PEO亲水链分布，在TEM测定前对样品的干燥、脱水和抽真空等处理，使纳米胶束水化层皱缩，纳米胶束粒径缩小[14]。3.4c(RGDyk)DTX-NPs药物分散状态DTX在水中溶解度极低，为高结晶药物，而c(RGDyk)-PL-188材料纳米胶束载药量可达7.88%，显著增加DTX在水中的溶解性。因此，本研究进一步利用DSC检测c(RGDyk)DTX-NPs中DTX分散状态，为后续载药稳定性研究提供依据。DSC结果如图3A所示，DTX原料药在160℃出现晶体熔点吸热峰，214℃处则为药物热降解峰;c(RGDyk)-PL-188聚合物材料在52℃则出现PEO链有关的吸热峰;DTX与c(RGDyk)-PL-188聚合物材料的简单物理混合物则出现二者相关峰的叠加;相比之下，c(RGDyk)DTX-NPs则仅仅出现微弱的PEO有关吸热峰，DTX相关的晶体熔点峰以及热降解峰消失，表明DTX在胶束中以分子形式分散存在。c(RGDyk)-PL-188聚合物的PPO链与DTX间疏水作用可能是维持DTX在胶束内高度分子分散稳定存在的基础。A、C:c(RGDyk)-PL-188空白纳米胶束;B、D:c(RGDyk)DTX-NPs图2纳米胶束粒径分布和TEM形态3.5c(RGDyk)DTX-NPs在模拟体液中的稳定性前已述及c(RGDyk)DTX-NPs中药物以分子分散的高能态存在，为一种不稳定存在形式，因此，本研究进一步对c(RGDyk)DTX-NPs在含有BSA的pH7.4PBS介质中粒径和载药稳定性进行考察。结果如图3B、3C所示，c(RGDyk)DTX-NPs在pH7.4PBS溶液和含有BSA的pH7.4PBS溶液37℃连续孵育24h，其粒径与胶束内药物浓度没有发生明显变化，各个时间点c(RGDyk)DTX-NPs粒径维持在155~162nm间，胶束内药物浓度变化小于10%，浓度维持在190μg/mL以上。这些结果表明c(RGDyk)DTX-NPs在模拟体内条件下，具有较好的纳米形态与载药稳定性，为其静脉注射肿瘤靶向提供前提依据。3.6体外药物释放动态透析法考察DTX在pH7.4PBS介质中从c(RGDyk)DTX-NPs制剂体外释放行为。结果如图3D所示，相比DTX溶液剂，c(RGDyk)DTX-NPs制剂展现出明显的缓释行为。DTX溶液剂在2h内累计释放达到77.04%，12h内释放高达91.71%，BDAC002020202050501001002002005005001k1k1010404060608080100100粒径(nm)强度强度粒径(nm)-787-第11期第49卷而在2h内c(RGDyk)DTX-NPs累计释放仅为30.40%，12h内累计释放仅为64.44%，甚至24h释放才达78.51%。胶束包裹产生的DTX短时缓释行为有助于静脉注射给药后，c(RGDyk)DTX-NPs通过增强渗透滞留效应靶向肿瘤组织，更适用于实际的治疗需要。3.7体外细胞毒性为了证实c(RGDyk)DTX-NPs对脑胶质瘤细胞耐药的逆转，本研究选择两种细胞株分别为耐DTX的脑胶质瘤U87细胞和敏感的C6胶质瘤细胞进行体外细胞毒性实验。结果如图4所示，c(RGDyk)-PL-188材料对两种细胞株在测试浓度范围内均无毒性，各个浓度细胞存活率均大于90%。对敏感的C6细胞，含DTX的各种制剂包括DTX溶液、DTX-NPs和c(RGDyk)DTX-NPs均展现出浓度依赖的细胞毒性，IC50分别为6.65、4.53、3.02μg/mL。这表明包裹在聚合物纳米胶束中的药物相对于单纯药物溶液具有更强的细胞毒性，其机制可能是胶束中的药物以内吞的机制进入细胞，使得更多药物转运至细胞内靶位，进而杀伤肿瘤细胞[15]。相比之下，耐DTX的脑胶质瘤U87细胞则展现出明显的耐药性，DTX溶液制剂IC50为106.91μg/mL，明显高于敏感的C6细胞计算的IC50。但两种DTX纳米胶束制剂包括DTX-NPs和c(RGDyk)DTX-NPs对耐药的脑胶质瘤U87细胞则显示出更明显的浓度依赖性细胞毒性，IC50分别为13.46μg/mL和8.26μg/mL，明显低于DTX溶液的IC50（P<0.05），表明纳米胶束有效逆转脑胶质瘤U87细胞对DTX的耐药性。耐药性的逆转可能与胶束材料PL-188抑制耐药P-gp介导的转运有关。而且，c(RGDyk)DTX-NPs相比DTX-NPs在多个浓度点对耐药的脑胶质瘤U87细胞展现出更强的细胞毒性。这是因为U87胶质瘤细胞膜过多表达αvβ3整合素，能更特异性吞噬c(RGDyk)DTX-NPs，更多药物绕开多药耐药蛋白进入细胞内。3.8c(RGDyk)ICG-NPs靶向性为了进一步确证c(RGDyk)-NPs对耐药U87胶质瘤细胞的靶向性，以荧光探针ICG代替DTX装载在纳米胶束内制备c(RGDyk)ICG-NPs，比较ICG-NPs和c(RGDyk)ICG-NPs在细胞内分布的差异。结果如图5所示，孵育2h后，ICG-NPs处理仅有微弱的药物分布在细胞质内。相比之下，c(RGDyk)ICG-NPs处理则在细胞质内出现明显红色荧光分布，表明c(RGDyk)-NPs具有更强的细胞靶向性。这种细胞质内高浓度药物摄取与其较强的细胞毒性结果相一致。而耐药U87胶质瘤细胞与c(RGDyk)溶液（10μg/mL）预孵育2h后再加入A:DSC分析结果;B:粒径稳定性;C:载药稳定性;D:在pH7.4PBS介质中的体外释放曲线图3c(RGDyk)DTX-NPs体外理化评价吴其隆，等:c(RGDyk)环肽修饰纳米胶束逆转脑胶质瘤对多西他赛的耐药性BDCAc(RGDyk)-PL-188聚合物DTX/c(RGDyk)-PL-188物理混合物PBSPBSDTX溶液DTX原料PBS-BSAPBS-BSAc(RGDyk)DTX-NPs1500020180155401906020016080165100210170120220粒径(nm)热流(W/g)粒径(nm)DTX浓度(μg/mL)885010121210016161520201502024242002502540405时间(h)时间(h)温度(℃)时间(h)-788-第49卷温州医科大学学报第11期A:c(RGDyk)-PL-188聚合物材料对C6胶质瘤细胞的毒性;B:c(RGDyk)-PL-188聚合物材料对耐药胶质瘤U87细胞的毒性;C:DTX溶液、DTX-NPs和c(RGDyk)DTX-NPs对C6胶质瘤细胞的毒性;D:DTX溶液、DTX-NPs和c(RGDyk)DTX-NPs对耐药胶质瘤U87细胞的毒性。aP<0.05，bP<0.01图4体外细胞毒性实验图5U87DTX耐药细胞对不同ICG制剂的摄取结果（×200）c(RGDyk)ICG-NPs进行摄取检测，结果发现细胞内荧光明显减弱，表明c(RGDyk)ICG-NPs靶向机制与细胞表面αvβ3整合素结合有关。3.9肿瘤球生长抑制研究报道，肿瘤干细胞是一种增殖失控的细胞，并且可能是肿瘤细胞产生耐药性的根源[16-17]。因此我们通过构建3DU87胶质瘤细胞球，体外考察了c(RGDyk)DTX-NPs对肿瘤球的生长抑制作用，结果如图6所示。在治疗后的第10天，未加药物的阴性对照组肿瘤球体积生长迅速，体积是原发灶的2.47倍;相反，DTX溶液组延缓了U87胶质瘤球体的生长，其第10天的体积是第0天的1.73倍;与DTX溶液组相比，c(RGDyk)DTX-NPs组显著增加了DTX对U87肿瘤球的抑制作用，差异有统计学意义（P<0.05），其第10天的体积是原发灶的0.5倍。表明c(RGDyk)的靶向性联合纳米胶束制剂能有效增加DTX对耐药肿瘤的杀伤作用。3.10肿瘤球渗透实验已有研究证实，肿瘤球与体内实际肿瘤具有某些相似的特征，包括实体瘤内部缺乏足够的氧气和养分、体内药物递送可能遇到的细胞外基质障碍等[18-20]。为了证实c(RGDyk)DTX-NPs在U87细胞三维实体肿瘤球中的渗透扩散行为，以ICG代替DTX制备荧光标记的c(RGDyk)ICG-NPs通过激光共聚焦显微镜断层扫描技术对U87肿瘤球进行了考察。结果如图7所示，ICG-NP、c(RGDyk)ICG-NPs分别与U87三维实体肿瘤球共孵育24h后，ICG-NP组红色荧光只在肿瘤球表面少量分布;而c(RGDyk)ICG-NPs组的红色荧光不仅分布于肿瘤球A040206080100120细胞存活率(%)255010020030040010c(RGDyk)-PL-188浓度(μg/mL)B040206080100120细胞存活率(%)255010020030040010c(RGDyk)-PL-188浓度(μg/mL)0.630.631.251.252.52.55510100.31DAPIICGICG-NPsc(RGDyk)ICG-NPsc(RGDyk)+c(RGDyk)ICG-NPsMerge0.31bbbbbbbbbbbbbbbbbbbaaabDTX浓度(μg/mL)DTX浓度(μg/mL)CD008080606040402020100100140140120120160160180180细胞存活率(%)细胞存活率(%)DTX溶液组DTX溶液组DTX-NPs组DTX-NPs组c(RGDyk)DTX-NPs组c(RGDyk)DTX-NPs组-789-第11期第49卷表面，而且其荧光能够均匀地渗透到肿瘤球的中心。这些结果表明，与ICG-NP相比，c(RGDyk)ICG-NPs具有更强的靶向穿透能力，其对肿瘤的这种更深的渗透可能使DTX被传递到肿瘤球的核心，从而抑制肿瘤核心和表面的生长，进而增强对肿瘤球生长抑制作用。4结论本研究以PL-188为纳米材料，利用其结构特点，经琥珀酸酐羧基化后，键合c(RGDyk)，实现对疏水性DTX装载，构建了包载DTX纳米胶束，初步探索其对耐DTX的人脑胶质瘤U87细胞的抑制效果。结果表明该聚合物胶束对DTX具有一定的载药量和包封率。A:空白对照组、DTX溶液组和c(RGDyk)DTX-NPs治疗3、6、10d后，U87肿瘤球的显微图（×200）;B:U87肿瘤球相对体积变化曲线。与DTX溶液组比:aP<0.05图6耐DTX的U87肿瘤球的生长抑制评价图7孵育24h后ICG-NP（A）和c(RGDyk)ICG-NPs（B）在U87肿瘤球的渗透情况（×200）吴其隆，等:c(RGDyk)环肽修饰纳米胶束逆转脑胶质瘤对多西他赛的耐药性TOPDay0ABBADay3Day6Day1015μm45μm75μm105μm36aaa9时间(d)3002001000相对体积比(%)DTX溶液组空白对照组空白对照组DTX溶液组c(RGDyk)DTX-NPs组c(RGDyk)DTX-NPs组-790-第49卷温州医科大学学报第11期体外释放实验表明，c(RGDyk)DTX-NPs较DTX溶液能明显延缓DTX的释放，呈现缓释释放行为，延长药物的作用时间。细胞毒性实验表明该聚合物胶束能高效地逆转U87耐药细胞对DTX的耐药性。药物摄取实验表明该聚合物胶束可被U87胶质瘤细胞快速摄取，能显著地增加后释放的DTX在细胞中的浓度，可有效地杀伤肿瘤细胞。体外肿瘤球实验也进一步证明了该纳米胶束能有效地渗透至肿瘤球核心进而抑制U87肿瘤球的生长。为了进一步确定该纳米胶束对动物模型的效果，需要进行体内药效学以及药动学的研究。参考文献:[1]HERBSTRS,KHURIFR.Modeofactionofdocetaxel-abasisforcombinationwithnovelanticanceragents[J].Can-cerTreatRev,2003,29(5):407-415.[2]GUÉRITTE-VOEGELEINF,GUÉNARDD,LAVELLEF,etal.Relationshipsbetweenthestructureoftaxolanaloguesandtheirantimitoticactivity[J].JMedChem,1991,34(3):992-998.[3]OGAWAC,YATABEM,INOUEM,etal.Comparisonofchemicalbehavioroforiginalandgenericdocetaxelformu-lationsasnon-alcoholicpreparations:discussionaboutdi-luentsolventsfordocetaxel[J].YakugakuZasshi,2018,138(7):973-984.[4]LUOZ,JIANGL,DINGC,etal.Surfactantfreede-liveryofdocetaxelbypoly[(r)-3-hydroxybutyrate-(r)-3-hydroxyhexanoate]-basedpolymericmicellesforeffectivemelanomatreatments[J].AdvHealthcMater,2018,7(23):e1801221.[5]RAFIEIP,HADDADIA.Docetaxel-loadedPLGAandPLGA-PEGnanoparticlesforintravenousapplication:phar-macokineticsandbiodistributionprofile[J].IntJNanomedi-cine,2017,12:935-947.[6]SIMT,KIMJE,HOANGNH,etal,Developmentofadocetaxelmicellarformulationusingpoly(ethyleneglycol)-polylactide-poly(ethyleneglycol)(PEG-PLA-PEG)withsuccessfulreconstitutionfortumortargeteddrugdelivery[J].DrugDeliv,2018,25(1):1362-1371.[7]ALSHRAIMMO,SANGIS,HARISAGI,etal,Chitosan-coatedflexibleliposomesma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