益气健脾通便方对慢传型便秘大鼠结肠组织ICC及SCF-c-kit信号通路的影响
【摘要】 目的：通过观察益气健脾通便方对慢传输型便秘模型大鼠结肠组织ICC表达的影响及对SCF/c-kit信号通路的修复作用，从理论上揭示益气健脾通便方治疗慢传输型便秘的可能作用机制。方法：采用“复方地芬诺酯灌胃法”复制慢传输型便秘大鼠动物模型，分别运用益气健脾通便方低、中、高剂量干预，并与西药聚乙二醇4000散对比。观察造模及治疗过程中各组大鼠粪便粒数的变化；采用免疫组化法检测大鼠结肠组织ICC的表达量及Western-Blot、RT-PCR法检测大鼠结肠组织c-kit、SCF蛋白的表达及c-kit、SCFmRNA的表达水平。结果：与模型组比较，聚乙二醇组、益气健脾通便方低、中、高剂量组均能明显提高慢传输型便秘大鼠24h粪便粒数（P<0.05）；与模型组比较，聚乙二醇组、益气健脾通便方低、中、高剂量组大鼠结肠组织ICC、c-kit、SCF蛋白及c-kit、SCFmRNA表达水平均显著升高（P<0.05）；与聚乙二醇组比较，益气健脾通便方中剂量组大鼠结肠组织ICC及c-kit、SCF蛋白表达均有所升高，但差异无统计学意义（P>0.05）；益气健脾通便方中剂量组大鼠结肠组织c-kit、SCFmRNA表达水平较聚乙二醇组明显升高（P<0.05）；益气健脾通便方高剂量组大鼠结肠组织c-kit、SCFmRNA表达水平较聚乙二醇组有所升高，但差异无统计学意义（P>0.05）。结论：益气健脾通便方治疗慢传输型便秘疗效显著，其作用机制可能与其提高结肠组织ICC的表达量及修复SCF/c-kit信号通路有关，从而改善便秘症状，以中、高剂量组疗效最为显著。关键词：益气健脾通便方；慢传输型便秘；ICC；SCF/c-kit信号通路；机制研究中图分类号：R285.5文献标志码：A文章编号：1673-7717（2019）01-0154-07EffectofYiqiJianpiTongbianRecipeonICCandSCF/c-kitSignalingPathwayinColonTissueofSlowTransportTypeConstipationRatsWANGJianmin1，LIMing1，TANGRan1，WANGPeisen2，XULiejuan3，ZHANGRun1，HANYin2（1.TheFirstAffiliatedHospitalofAnhuiUniversityofChineseMedicine，Hefei230031，Anhui，China；2.GraduateSchool，AnhuiUniversityofTraditionalChineseMedicine，Hefei230038，Anhui，China；3.TheFirstPeople`sHospitalofHefei，Hefei230061，Anhui，China）中华中医药154学刊Abstract：Objective：ThroughtheobservationofYiqiJianpiTongbianRecipeonexpressionofinterstitialcellsofCajalincolontissueofratswithslowtransitconstipationmodelandtherepairedeffectonSCF/c-kitsignalpathway.IttheoreticallyrevealsthepossiblemechanismofYiqiJianpiTongbianRecipetreatingslowtransitconstipation.Methods：WeusedCompoundDiphenoxylategavagemethodtoreplicateanimalmodelsofslowtransitconstipationinratsandusedlow，mediumandhighdoseinterventionsofYiqiJianpiTongbianReciperespectively.Wecomparedwesternmedicinepolyethyleneglycol4000powder.Weobservedthechangeofthenumberoffecespelletsinratsofeachgroupduringmodelingandtreatment.TheexpressionofICCincolontissuewasdetectedbyimmunohistochemistryandtheexpressionofc-kitandSCFproteinandtheexpressionofc-kitandSCFmRNAinratscolonweredetectedbyWestern-BlotandRT-PCR.Results：Comparedwiththenormalgroup，PolyethyleneglycolgroupandYiqiJianpiTongbianRecipelow，middleandhighdosegroupsallsignificantlyincreasedthenumberoffecalpelletsinratswithslowtransitconstipation（P<0.05）.Comparedwiththemodelgroup，theexpressionsofICC，c-kitandSCFprotein，c-kitandSCFmRNAinthecolontissueofratswithpolyethyleneglycol，YiqiJianpiTongbianrecipelow，middle，andhighdosegroupssignificantlyincreased（P<0.05）.Comparedwiththepolyethyleneglycolgroup，theexpressionsofICC，c-kitandSCFproteininthecolonofthemiddle-dosegroupofYiqiJianpiTongbianRecipewasincreased，butthedifferencewasnotstatisticallysignificant（P>0.05）.Theexpressionofc-kitandSCFmRNAinthecolontissueofthemiddle-dosegroupofYiqi基金项目：安徽省卫生和计划生育委员会中医药科研项目（2016zy02）作者简介：王建民（1958-），男，安徽郎溪人，主任医师，硕士研究生导师，学士，研究方向：中医药防治肛肠疾病。第37卷中第1期2019年1月CHINESE华ARCHIVES中OF医药TRADITIONAL学刊CHINESEVol.37No.1MEDICINEJan.2019JianpiTongbianRecipewassignificantlyhigherthanthatofthepolyethyleneglycolgroup（P<0.05）.Theexpressionlevelsofc-kitandSCFmRNAinthecolontissueofhigh-doseYiqiJianpiTongbianRecipegroupwerehigherthanthoseinthepolyethyleneglycolgroup，butthedifferencewasnotstatisticallysignificant（P>0.05）.Conclusion：ThetherapeuticeffectofYiqiJianpiTongbianRecipeonSTCissignificant，anditsmechanismmayberelatedtoincreasingtheexpressionofICCincolontissueandrepairSCF/c-kitsignaltransductionpathwaysoastoimprovethesymptomsofconstipationandthemostsignificanteffectwasseeninthemiddleandhighdosegroups.Keywords：YiqiJianpiTongbianRecipe；slowtransitconstipation；interstitialcellsofCajal；SCF/c-kitsignalingpathway；mechanismstudy慢传输型便秘（slowtransitconstipation，STC）是功能性便秘的一种常见类型，主要是由于肠道内容物传输减慢而引起的一类疾病，临床以大便干结、排便次数减少、排便费［1］力伴有腹胀等为主要症状。目前，STC的发病机制尚不μm）。1.3主要实验仪器脱水机（武汉俊杰电子有限公司JJ-12J）；包埋机（广州兆康生物科技有限公司KD-BM）；病理切片机（深圳汇能完全明确，近年来，越来越多的专家学者对其发病机制展［2］开研究，相关研究表明Cajal间质细胞（interstitialcellsofCajal，ICC）具有肠道运动起搏器的功能，是消化道的兴奋沃科技有限公司HW-1500A）；组织摊片机（深圳汇沃科技有限公司HW-PII）；显微镜（尼康E100）；组织匀浆机（上海净信Tissuelyser-192）；低温高速离心机（Eppendoorf5415R）；涡旋混合器（Servicebio）；核酸电泳仪（北京六一仪传导细胞细胞，起着协调胃肠道动力的作用。c-kit基因［3］是ICC的特异性标志物，与配体干细胞因子（StemCellFactor，SCF）结合，启动SCF/c-kit信号通路，引发基因的特异性表达，调控细胞的增殖与分化，从而调节胃肠道平滑肌的运动功能。在STC的治疗上，中医有其独特的优势，［4-5］本课题前期大量研究表明益气健脾通便方治疗STC疗效确切，本研究通过中药干预STC模型大鼠，观察益气健脾通便方对STC大鼠结肠组织ICC及SCF/c-kit信号通路表达的影响，从多角度来探讨益气健脾通便方治疗STC的效果和作用机制，从而为进一步开发中医药治疗STC提供良好的理论基础。1材料1.1动物SPF级8周龄wistar雄性大鼠60只，体质量（200±20）g，由安徽省动物实验中心提供，生产许可证号：SCXK2012（皖）0005。大鼠饲养于安徽中医药大学实验中心，室内温器厂DYY-11）；恒温水浴锅（上海慧泰仪器制造有限公司HWS-11）；蛋白半干转印系统（BIO-RADTrans-BlotSD）；水平摇床（上海一恒科技有限公司HZQ-X100A）；紫外可见分光光度计（上海上分计量检测有限公司）；荧光定量PCR仪器（加拿大MA-6000）；酶标仪（BIO-RAD）；微量核酸定量仪（ThermoNarodrop2000）。2实验方法模型制备60只大鼠适应性饲养1周后，随机分为正常组、模型组、聚乙二醇组、益气健脾通便方低、中、高剂量组，每组10［6］只。参照文献制作STC大鼠动物模型的方法，将除正常组以外的其余5组大鼠运用复方地芬诺酯混悬液灌胃法2.1（10mg·kg-1·d-1）制作STC大鼠动物模型，正常组大鼠不造模，以等量生理盐水灌胃，每天均灌胃1次，连续14d。末次灌胃结束后，所有大鼠均禁食不禁水24h后，依次给以10%活性炭混悬液按4mL/kg灌胃，立即将大鼠放入代度、湿度、光度保持在正常饲养范围，自由进水，摄食，适应性饲养1周。1.2药物与试剂益气健脾通便方（白术20g，黄芪15g，党参15g，炒枳实15g，当归15g，生首乌10g，陈皮10g，杏仁10g，肉苁蓉2.29g，炙甘草6g，由安徽中医药大学第一附属医院中药房提供，由煎药室代煎成水煎剂），含生药浓度为1.2g/mL，备用；聚乙二醇4000散：马应龙药业集团（批号：国药准字H20080092），制成浓度为0.1g/mL的溶液，备用；复方地芬诺酯：中孚药业有限公司（批号：H41023578）；10%活性炭混悬液（合肥知恩生物技术有限公司）；甲醛溶液（浙江金华同和生物有限公司）；柠檬酸（pH为6.0）抗原修复液（合肥知恩生物技术有限公司）；PBS缓冲液（合肥知恩生量转换关系，计算各组大鼠的给药剂量。益气健脾通便方12、18g/kg生药浓度为低、中、高剂量组大鼠分别按每日6、1.2g/mL益气健脾通便方灌胃；聚乙二醇组大鼠每日按1g/kg浓度为0.1g/mL聚乙二醇400散水溶液灌胃；正常组、模型组大鼠每日按10mL/kg等量生理盐水灌胃。每日上午9点左右灌胃，连续4周。2.3取材物技术有限公司）；BSA（合肥知恩生物技术有限公司）；UNIQ-10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒（上海生工公司）；一抗：山羊SCF多克隆抗体、兔c-Kit多克隆抗体、兔GAPDH多克隆抗体（abcam）；二抗：山羊抗兔IgG-HRP二抗、驴抗山羊IgG-HRP二抗（上海生工生物工程股份有限公司）；正常兔血清（合肥知恩生物有限公司）；牛血清白蛋白（上海生工公司）；PVDF膜（德国默克密理博公司0.22谢笼中，单鼠单笼，从活性炭混悬液灌胃后开始计时，记录每只大鼠首粒黑便排出时间，结合大鼠的一般情况对模型［7］制作效果进行评价。药物干预［8］模型制作成功后，参照文献中关于人与大鼠用药剂末次给药结束后，各组大鼠均禁食不禁水24h后，颈椎脱臼处死后立即剖腹，取大鼠结肠组织，生理盐水冲洗肠内容物，分别装入预先分组的甲醛溶液和冻存管中，冻存管放入-80℃冰箱中冻存，备免疫组化、WesternBlot及RT-PCR检测。2.4观察指标2.4.1STC大鼠模型制作情况观察造模结束后各组大中华中医药155学刊第37卷中第1期2019年
