精子功能指标在辅助生殖助孕方式选择中的作用
【摘要】 2017精结局不同分为年1月至组IVF（n=331）。评估精子功能参数对精子常规体外受精能力的预测价值年月于我院首次行体外受精201912胚胎移植-（IVF-ET）短时受精的组受精失败或受精率:2<30%比较两组患者精子前向运动的患者为早补救卵胞浆内单精子注射（PR）、精子浓度精子正常形态率、探寻有效选择受精方式的新指标，。个周期的临床资料429组（R-ICSI）顶体酶活性、（n=98）;顶体反应、受精率（AR）、方法回根据受，的为≥30%酪氨酸磷及透明质酸结合试验（HBA）等指标采用;Logistic回归分析影响受精的独立危险因素并绘制受试者工作曲线短时酸化（ROCTP（TP）曲线HBAHBA评估各项危险因素对）IVF比较均无显著性差异。组患者的精子浓度受精率的预测价值结果两组患者精子的正常形态率（P>0.05）;R-ICSI回归分析显示精子，PR、IAR和的曲线下面积（Pre-1）为IVFHBA分别为（AUC）0.66、0.62、0.640.70。和、PR、诱发顶体反应（IAR）受精率的独立危险因素和（P<0.05）。Logistic和联合预测新变量，顶体酶活性、自发、均显著低于短时和组ARIVF曲线显示精子精子功能指标中PR、IAR、和IARHBA;ROC结论受精率的独立危险因素是影响IVF[关键词][中图分类号]R321;R711.6[文献标识码]A其对辅助生殖助孕方式的选择有一定指导意义，受精率透明质酸结合率-短时受精受精失败顶体反应精子;;;;。EffectofspermfunctionparametersonselectionofassistedreproductivemethodsXUShi-yan，TUWen-jiao，ZHUKe-heng，LIUYu*DepartmentofFamilyPlanning，ShenzhenPeople`sHospital（TheSecondClinicalMedicalCollege，JinanUniversity;TheFirstAffiliatedHospital，SouthernUniversityofScienceandTechnology），Shenzhen518020[Abstract]Objective:Toevaluatethevalueofspermfunctionparameterstopredictfertilizationrateinvitro，andexplorenewindicatorsforselectingfertilizationmethod.Methods:Theclinicaldataof429IVFcyclesinitiallyperformedinShenzhenPeople`sHospitalfrom2017to2019wereretrospectivelyanalyzed.Thecyclesweredividedintotwogroupsaccordingtotheoutcomeoffertilization:earlyrescueICSI（R-ICSI）group（n=98）forpatientswithfertilizationfailureorfertilizationrate<30%;short-termIVFgroup（n=331）forpatientswithfertilizationrate≥30%.Thespermprogressiverate（PR），spermconcentration，spermnormalmorphologyrate，acrosinactivity，acrosomereaction（AR），tyrosinephosphorylation（TP）andspermhyaluronicacidbindingassay（HBA）werecomparedbetweenthetwogroups.LogisticregressionanalysiswasusedtoanalyzetheindependentriskfactorsofIVFfertilization.Thereceiveroperatingcurve（ROCcurve）wasdrawntoevaluatethepredictivevalueofriskfactorsforIVFfertilizationrate.Results:Therewerenosignificantdifferencesinspermnormalmorphologyrate，acrosinactivity，spontaneousARandTPbetweentheR-ICSIgroupandtheshort-termIVFgroup（P>0.05）.Thesperm收稿日期[作者简介[修回日期]2020-09-12;[许世艳女，山东聊城人，]]2020-10-23博士研究生，主管技师，遗传学专业，.（*通讯作者，Email:90098687@sina.com）·833·生殖医学杂志2021年月第卷第期3303concentration，PR，inducedacrosomereaction（IAR）andHBAintheR-ICSIgroupweresignificantlylowerthanthoseinshort-termIVFgroup（P<0.05）.LogisticregressionanalysisshowedthatspermPR，IARandHBAweretheindependentriskfactorsofIVFfertilizationrate.Furthermore，ROCcurveshowedthattheareaunderthecurve（AUC）ofPR，IAR，HBAandnewcombinationvariable（Pre-1）were0.66，0.62，0.64and0.70.Conclusions:Amongthespermfunctionparameters，IARandHBAareindependentriskfactorsforIVFfertilizationrate，whichhavecertainguidingsignificanceforselectingassistedreproductionmethod.Keywords:Short-termfertilization;Fertilizationfailure;Fertilizationrate;Spermhyaluronicacidbindingassay;Acrosomereaction（JReprodMed2021，30（03）:337-342）周期的在常规体外受精低受精率是不可避免的低受精率占（IVF）助孕过程中受精失败及其中完全受精失败率约为，IVFIVF5%~20%[1-2]。低受精和完全不受精的原因尚未明确。而完全受精失败，这些都将影响助孕效，短时受的患者实施早补救卵5%~10%，造成常规低受精导致卵母细胞的利用率降低导致患者的助孕过程提前终止果并造成患者精神及经济的双重负担精后对第胞浆内单精子注射在没有扩大ICSI低受精的发生率（EarlyRescueICSI，R-ICSI），R-ICSI指征的前提下降低了受精失败和，深受辅助生殖业界学者的欢迎，极体数量少于。IVF30%2。，，。IVFIVF如果对每个受精失败与否的主要方式有学者发现短时受精会影响受精卵原核发育并观察短时受精情况成为导致多精受精比例增加[3]。预测但短时受精可，能因为卵母细胞老化错过最佳受精时机而导致胚胎发育受影响周期都行早期去颗所以我粒细胞势必会加重实验室人员的工作压力们需要探寻预测受精失败的生物标志物以指导胚胎实验室人员为患者选择最佳助孕方式防止受精失在临床败的发生同时又能不过度使用短时受精，但很难上虽然精液常规检查提供了有价值的资料预测精子的受精能力也很难判断可能存在的受精仅依据常规精液参数很难选择最佳助孕方式障碍。或因此寻找可靠的精子功能指标是必ICSI），（IVF目前生殖医学界研究较多的有精子形态学检要的查但精液常规和精子，形态等传统分析项目并不能满足临床深层次评价精子质量的需求增加受孕通过探寻新的预测受精失败与否的潜在的成功率，生物标志物来选择有效助孕方式已成为一种趋势本研究回顾性分析我院生殖中心首次行。月于1短时受精患者的临床资。顶体酶活性、为减轻患者的经济负担碎片率等、DNA20172019月至12年年。，。、，IVF筛选影响，在分析男性精液常规参数的基础上比较精子功，受精的曲旨在探讨这些指标单独或联合评估男性生育力进而为选择最佳受精方式提，料能指标与受精率之间的关系独立危险因素线及供一些实验室依据并绘制受试者工作曲线受精率的价值（ROCIVFIVF），，。资料与方法一研究对象、回顾性分析院生殖中心首次行纳入标准;（3）排除标准枚数果受精失败≥4。。年月至年月于我20171短时受精夫妇的临床资料201912IVF女方年龄。女方获卵:（1）男性患者均有精子功能指标的数据结排除卵母细胞未成熟或异常导致的:;（2）≤45岁本研究共纳入个周期429分为2组受精失败或受精率:受精率≥30%主要试剂及仪器、的为短时<30%的为组IVF（n=98），二二氧化碳培养箱计算机辅助精子分析仪根据受精结局不同，组R-ICSI（n=331）。日本（AMP-30D，Astec，），SCA5（Computer-AidedSemenAnal-相差荧光显微镜（OLYMPUS辉光型化学发光照度计（FB12，精子顶体酶活性测定试剂盒诱发、），），西班牙日本ysis，CASA，BX51，Olympus，德国Berthold，精子顶体反应）;（AcrosomeReactionAfterIonophore精子酪氨酸磷酸化精子-试剂盒等均购自深圳市博检测试剂盒challenge，ARIC）精子染色试剂盒（TP）、透明质酸结合试验锐德生物科技有限公司输卵管缓冲液（Diff-Quik）、检测试剂盒（HBA）、1023，Sage，），IVF（ART-1020，Sage，美国;IVF授精液三研究方法、精液常规及形态学分析1.男方检测前均须禁:（ART-美国）。生殖医学杂志2021年月第卷第期3303·933·于37℃、5%CO2培养箱中获能，含有活动精子的培养液0.8~1.0ml涂片、结合物自然干燥过夜反应固定覆以、单克隆抗体TP，在荧光显微镜下观察结果，。-FITC吸取最上层洗涤精子后2h，，:两组患者一般资料精子正常形态率4℃观察指标精子浓度及、等子6.PR、AR、TP精子数HBA孔活动精子总数。HBA）×100%;AR×100%;反应的精子数量发生率/“T”孔活动精子总数=诱发管中发生AR×100%;TP“C”发生率被观察的精子总数管中发生精子总数量/子数/计数的精子总数精子数四统计学方法、采用计数的精子总数被观察精子总数/SPSS16.0×100%。PR×100%，×100%。、男性患者精、顶体酶活性、孔被结合=（“T”孔被结合精子数/发生率-“C”诱发顶体反应的精子数量自发=/发生率（IAR）诱发管中自发AR自发管中被观察的发生的精子数前向运动精率正常正常精子率TP=/==±计数资料以率，量资料以均值检验用多因素功能指标对LogisticIVF标准差软件进行数据统计学分析计。表示均数比较采用（珚x±s），t表示相关危险因素分析采（%），曲线评价精子回归分析并得出影响，为差异有统计。ROC受精率的诊断效能。P<0.05。结果通过手淫法对精液标本进行采集SCA5按照第;欲2~7d，液化后应用常规分析5实验室手册[4]标准力精子活动率、精子WHO版分析精液量，前向运动精子待标本，计算机辅助精子分析仪实施精液人类精液检查与处理精子活非前向运动精子形态学分析采用等[5]的标准法进行精子浓度、（PR）+按照及精子形态（NP）]法染色;[、，KrugerDiff-Quik形态分类计数。苯甲酰顶体酶活性定量采用固相:。，N-α-2ml0.5ml4ml，（BAPNA）内完成检测硝酰基苯胺离心后制成-ρ-在锥形离心管中加入，2.-DL-精胺酸法检测精子顶体酶活性新鲜精液以及精子洗液收集约精子悬液7.5×106个精子后按照精子顶体酶活性测定试剂盒要求在孔“T”精液会自然扩散到片，内加入液化的精液）60min所有步骤均严格按照试剂盒说明书要3.HBA:即在包被有透明质酸的载玻片表面的，盖上盖玻测定孔（10μl，室温反应，用普通光学显微镜或相差显微镜观察记录精子尾部持续鞭打但头部被成熟500结合在玻片表面难以自由前行的精子数量精子个活动精子求进行检测对照孔10min“C”孔内后（），，（试剂盒的操作要求，1×106个度调整至条件下孵育/mlA231873h，诱发CO2、37℃入钙离子载体管不加钙离子载体但同步孵育涤精子记镜下分别观察并计数将:固定、过夜检测（PSA-FITC）4℃自然干燥、涂片、检测。1ml5.TP无菌试管中小心加入，1.2ml后等分成管放置于，215min（以诱导精子获能诱发管5%一管加;另一洗15min（），以豌豆凝集素荧光标，在荧光显微），自发管状况AR，液化的新鲜精液放入获能培养液后5ml放置，）。4.精子顶体反应检测检测将密度梯度法提取后的精子浓（AR）ARIC依照:IVF学意义受精率的最佳截断值一两组患者临床资料比较、两组中女方一般资料比较1.与短时:IVF组相比，R-ICSI组女方的不孕年限显著增长基础体重指数两组的年龄、总促性腺激素0.05），LH、E2、卵数等比较均无显著性差异（Gn）（BMI）、用量使用天数、Gn表（P>0.05）（1）。（P0.05）;R-ICSI组患者的、HBA、IAR2）。IVFPR组别周期数表2年龄两组男性患者精液常规及功能参数比较（x±s）BMI（kg/m2）顶体酶（μU/106）HBA发生率（%）自发AR发生率（%）组组短时IVF组R-ICSI组别短时IVF组R-ICSI注与短时:IVF33133.2±5.124.6±2.9112.3±54.175.5±15.05.8±2.99833.8±6.323.9±2.9发生率发生率周期数IAR（%）TP104.9±49.1（%）精子浓度67.7±19.6*率（×106/ml）PR（%）5.8±2.9正常形态率（%）33138.0±11.27.0±2.691.2±66.655.9±17.35.5±3.698组比较33.1±11.3*6.8±3.372.2±55.9*45.4±20.0*5.1±4.3，*P<0.05二多因素、率的影响Logistic分析精液参数对IVF以上述差异有统计学意义的因素包括精子浓精子将这、发生率和发生率率，、IARHBAPR度LogisticHBA表（3）。受精次因素作为自变量以受精率为因变量，进行多因素，精子发生率和，受精率低的独立危险因素、IARPR率回归分析发现发生率是导致IVF表3Logistic回归分析各项精液参数对体外受精率的影响IVF影响因素精子浓度（×106/ml）PR（%）IAR（%）HBA（%）β0.00-0.03-0.03-0.02Sx0.000.010.010.01WaldPOR95%CI0.7812.129.064.360.380.000.000.041.000.980.970.99（0.99，1.00）（0.96，0.99）（0.95，0.99）（0.97，1.00）三以曲线、ROCR-ICSIHBA、IAR、对研究量图Pre-12）。IVF经过分析，HBA[95%CI（0.58，0.70）]，和特异度分别为为71.43%组为实验组精子浓度受精率的鉴别诊断效率组为对照组，联合预测新变和短时，精子、PR、IVF曲线下面积最佳截断值和56.19%;IAR图（为1（AUC）78%，0.64其灵敏度的AUC最佳界值为和54.08%0.60[95%CI（0.53，其灵敏度和特0.62[95%CI（0.55，0.68）]，其灵敏度和特异度分别为精子浓度的最佳临界值为和30×106/ml，精子AUC为68.37%47.73%;32.5%，65.56%;0.66）]，异度分别为为0.66[95%CI（0.60，0.72）]，其灵敏度和特异度分别为33.8%，70.09%。为多因素Logistic回归新变量AUC0.70[95%CI（0.64，0.76）]，的PRAUC最佳临界值为和的灵敏度和特异57.14%Pre-1和66.33%度分别为及指标对精结果判断具有一定的诊断价值66.16%。IVF以上各项精子参数对受，表（4）。受精率的影响均有统计学意义图1单个精液参数及精子功能指标预测受精率的曲线ROCIVF生殖医学杂志2021年月第卷第期3303·143·。IVFIVF有关ICSI采用，HBA、IAR会导致受精率低≤1%我们的研究数据发现精子、PR密切相关率均与受精率有关分其与受精失败的关系率的患者≤2%提高正常受精率[10]。败风险，精子形态学对受精率有影响，精子正常形态率研究中展开）。仅和精子浓度的透明带黏液基质的主要成分能性精子的选择起关键作用过程中细胞凋亡成以及成熟度等有关[11]。相透明质酸的结合能力，大的临床意义有助于择和细胞质的完整性。明质酸结合的能力但仍没有确切的标准来划，有报道指出精子正常形态授精方式能降低受精失但本研究中尚未发现对标本分段统计发现数据未在本（受精率不还与精子功能指标中，透明质酸是卵母细胞和受精过程中功对，IVF透明质酸与精子发育非整倍体染色体形、检测精子与固对预测精子受精能力有很治疗方式的选包括细胞核，只有成熟的精子才能获得与透之前有不少学者通过比较率与受精率之间的相关性来探讨其对于受精可以客观反映精子的成熟度。碎片化通过。HBA、DNAICSIHBAIVF或。。，HBA能力的预测价值[11-15]。，，时XuARARARAR，AR<21%建议当IVF率体外诱导其预测，完全不受精的A23187是AR，WHO。KatsukiIAR方案提供方向值是AR若顶体的结构和功能有损;精子，使用钙离子载体在精子内部发生，21%，等[17]的研究团队利用治疗的不育夫妇进行回顾性研究发现完成受精子失去受精能力潜能。获能后精子受精能力的较好指标是受精的必备条件受精过程中精子必须才有可能穿入透明带与卵膜融合从而完成不足会导致精具有评价男性生育力的Ca2+进入推荐的评估等[16]认为能为不孕不育患者选择适当的辅助生殖治疗率阈治疗。例行受我们的研究数据也组比较具有显为最佳IVF精率与发现著性差异界值为54.08%和受精率的价值高顶体。酶活性预测这与之前文献[18-20]的结论不太一致组的精子样本总数少或者精子活力差尤其是那些精子总数，少同时又合并精子活力差的患者精子数量不够完成，功能指标检测受精率的价值不大可能是因为，IAR（P<0.05）。IAR存在显著正相关组患者的同时我们的数据还提示自发其灵敏度和特异度分别为本研究还发现精子浓度65.56%（P<0.001），选择，分析对。率与的32.5%，0.62，R-ICSIR-ICSIAR、，IVFICSIAUC精子预测提示metaIARIARIVFIVFIVF737，、PR、。图2多因素联合变量Pre-1预测IVF受精率的ROC曲线表4ROC曲线分析筛选指标对IVF受精率的诊断效能因素截断值AUC约登指数敏感度特异度（%）（%）值PHBA（%）0.6478.000.2871.4356.190.00IAR（%）0.6232.500.2054.0865.560.00精子浓度0.6034.910.1668.3747.730.00PR（%）0.6633.800.2757.1470.090.00Pre-10.700.220.3366.3366.160.00讨论过程不能完全避免受精失败的发生受精，IVF，，IVF因此且，ICSIICSIR-ICSI受精率低下5%~20%。5%~10%，治疗周期中约占的操作过程可能会损伤卵母细胞（<30%）对受精会增大胚胎学家的工作量失败的患者约占的患者在率低的周期进行同时还可能会将染色体异常的精子注射到卵母细胞中，遗传给子代[6]。辅助生殖助孕方式的选择需许多生殖中心目前都是在精液常规检查的基慎重。础上以及精子正常形态率根据精子浓度，选择或然而这种评估的诊断ICSI敏感性很低并不能满足临床深层次评价精子质量，操在男性因素造成的不育病例中的需求[7-9]。男性患者的精子常规检查结果正作前约有常[7]。的患者上述我们需要综合评估精子功能指标及本研究中项精子指标正常，如顶体酶活性，R-ICSI。41%（40/98）组有因此授精方式精子、，IVF精子IVF15%PR，3、AR、PR，HBA预测它们对受精率的影响，等目前认为精子浓度精子、PR。及精子正常形态·243·生殖医学杂志2021年月第卷第期3303以及与精子受精率有关多因素DNAfragmentation，hyperactivation，andhyaluronan-bindingabilitypredictiveforfertilizationandembryodevelopmentin?invitrofertilizationandintracytoplasmicsperminjection[J].FertilSteril，2013，99:1233-1241.[8]WangC，SwerdloffRS.Limitationsofsemenanalysisasatestofmalefertilityandanticipatedneedsfromnewertests[J].FertilSteril，2014，6:1502-1507.[9]PatelAS，LeongJY，RamasamyR.PredictionofmaleinfertilitybytheWorldHealthOrganizationlaboratorymanualforassessmentofsemenanalysis:asystematicreview[10][J].ArabJUrol，2017，1:96-102.刘闯等马媛，刘忠尖，，.生殖医学杂志妊娠结局的影响[J].异常形态精子对植入前胚胎发育和，2020，29:198-203.[11]DimitriadisI，LBormannC，KanakasabapathyMK，etal.Automatedsmartphone-basedsystemformeasuringspermviability，DNAfragmentation，andhyaluronicbindingassayscore[J/OL].PLoSOne，2019，14:e0212562.doi:10.1371/journal.pone.0212562.[12]MokánszkiA，TóthnéEV，BodnárB，etal.Isspermhyaluronicacidbindingabilitypredictiveforclinicalsuccessofintracytoplasmicsperminjection:PICSIvs.ICSI[J].Syst?[13]BiolReprodMed，2014，60:348-354.王金香人精子邱孙全，叶英辉，结局相关性研究等，生殖与避孕.透明质结合试验与-IVF-ET[14]杨雪莲赵焕，[J].罗宇富，.，2015，35:247-251，281.短时受精中不同受精结局组间精子透明质酸结合率及妊娠率的比较中华生殖与避孕杂志[J].-，2017，37:896-899.[15]MarchlewskaK，FilipiakE，Walczak-JedrzejowskaR，etal.SpermDNAfragmentationindexandhyaluronanbindingabilityinmenfrominfertilecouplesandmenwithtesticulargermcelltumor[J].BiomedResInt，2016，2016:7893961.doi:10.1155/2016/7893961.[16]KatsukiT，HaraT，UedaK，etal.Predictionofoutcomesofassistedreproductiontreatmentusingthecalciumionophore-inducedacrosomereaction[J].HumReprod，2005，20:469-475.。。IARHBA回归分析提示精子率是IVF分析预测IVF率PR、IAR发生率和HBA联合变量受精率的独立危险因素受精失败的价值要高于单个指标Logistic发生Pre-1其，AUC。HBA的检测精子更新时间大约为为目前尚没有生殖中心能在取卵当天0.70[95%CI（0.64，0.76），P=0.000]。即在授精，前完成精子相关功能指标包括顶体酶活性、AR、TP一般及本研来说在这段时间内精子的各项指标波动不大我们希望能通过周期究所用精液为取卵前的精液内男方精子功能指标的检测指导助孕患者选择最佳助孕方式而不仅仅是为了研究我们的资料还提示组程中越容易出现受精障碍限较长的患者在临床中要予以足够的重视，R-ICSIIVF提示不孕年限越高的女性在行辅助生殖助孕过，对于那些不孕年组女方的不孕年限要显著高于短时70+d，。因此，。。，在辅助生殖技术治疗过程中和精子正常形态率均影响。IVF在行PR精率的预测能力有限的各项指标子功能指标的检测和的预测受精结果的潜在生物标志物孕方式的选择有一定的指导意义特别是IARIVF，。，，。精子浓度的成败精子、但对受前有效判断精子精可作为新HBA对辅助生殖助。，可减少选择受精方式时的盲目性，[参考文献][1]SunB，YehJ.Calciumoscillatorypatternsandpocyteactivationduringfertilization:apossiblemechanismfortotal?fertilizationfailure（TFF）inhumaninvitrofertilization[J].ReprodSci，2021，28:639-648.[2]TangL，RaoM，YangW，etal.PredictivevalueofthespermDNAfragmentationindexforloworfailedIVFfertilizationin[17]XuF，GuoG，ZhuW，etal.Humanspermacrosomefunctionmenwithmild-to-moderateasthenozoospermia[J].JGynecolObstetHumReprod，2020，doi:10.1016/j.jogoh.2020.101868.丁晨晖短时受精后提早剥离颗粒细胞对魏思达等[3]王静，，体外受精的影响.，中山大学学报[J].医学科学版（），2016，37:71-76.[4]WorldHealthOrganization，DepartmentofReproductiveHealthandResearch.WHOlaboratorymanualfortheexaminationandprocessingofhumansemen[M].5thedition.assaysarepredictiveoffertilizationrateinvitro:aretrospectivecohortstudyandmeta-analysis[J].ReprodBiolEndocrinol，2018，16:81.doi:10.1186/s12958-018-0398-y.刘树沅精子自发顶体反应率与体外受[18]韦剑洪，等，精胚胎质量的相关性研究陈伟辉，.检验医学与临床[J].，2018，15:16-18.刘群龙[19]宋博，周亮，等，精子形态率.顶体酶活性对、IVF受精失败的影响国际泌尿系统杂志[J].，2016，36:398-400.Geneva:WHOPress，2010:7-160.[20]Sáez-EspinosaP，Ferrández-RivesM，Huerta-RetamalN，etal.[5]KrugerTF，MenkveldR，StanderFS，etal.SpermmorphologicPropercytoskeletonα-tubulindistributionisconcomitanttofeaturesasaprognosticfactorininvitrofertilization[J].Fertil[6]Steril，1986，46:1118-1123.王雪莹姚冠峰，等，谢聪聪，行早期补救的应用ICSI[J].完全常规.生殖医学杂志IVF/部分受精失败后，2020，29:306-310.[7]PreglBreznikB，KovaˇciˇcB，Vlaisavljevic′V，etal.Arespermtyrosinephosphorylationduringinvitrocapacitationandacrosomalreactioninhumanspermatozoa[J].Cytoskeleton（Hoboken），2020，77:333-341.编辑[丁宁:]
