羟基红花黄色素A对氧化应激损伤血管内皮细胞的保护作用研究
【摘要】 )目的探讨羟基红花黄色素A（hydroxysaffloryellowA，HSYA）对血管内皮细胞氧化应激损伤的保护作用及其可能机制。方法体外培养人血管内皮细胞EC-304，用H2O2构建细胞氧化应激损伤模型，分别设置正常对照组、H2O2损伤模型组、HSYA药物组，其中各药物组用不同浓度的HSYA预培养细胞24h后加入50μmol/L的H2O2，继续培养12h。用MTT法检测细胞的增殖活力，用试剂盒检测各组细胞内超氧化物歧化酶（SOD）、一氧化氮（NO）的含量，用WesternBlot法检测各组细胞Bax、Bcl-2、Caspase-3、cleavedCaspase-3蛋白表达水平。结果与H2O2模型组相比，HSYA能显著提高细胞存活率，且呈剂量依赖性，提高细胞内SOD的活性，提高细胞内NO的含量，降低Bax表达，提高Bcl-2表达，降低Caspase-3和cleavedCaspase-3的表达（P<0.01或P<0.05）。结论HSYA对于H2O2诱导的血管内皮细胞氧化应激损伤具有保护作用，其可能的作用机制与抑制EC-304细胞凋亡相关。(关键词)羟基红花黄色素A;血管内皮细胞;氧化应激损伤;细胞凋亡(中图分类号)R285.5(文献标志码)A(文章编号)doi:10.3969/j.issn.1674-070X.2019.04.009ProtectiveMechanismofHydroxysafflorYellowAonVascularEndothelialCellsInjuredbyOxidativeStressCUILixia1,SUNLiping1,ZHAOPiwen1,LIUXin2,SHIDanning1,CHENMeng1*(1.BeijingUniversityofChineseMedcine,Beijing102488,China;2.TheThirdAffiliatedHospitalofBeijingUnivesityofChineseMedicine,Beijing100029,China)(Abstract)ObjectiveTostudytheprotectivemechanismofhydroxysaffloryellowA(HSYA)onvascularendothelialcellsinjuredbyoxidativestress.MethodsEC-304humanvascularendothelialcellswereculturedinvitro.AnoxidativestressinjurymodelwasestablishedwithH2O2.Thecellsweredividedintoseveralgroups,namelycontrolgroup,H2O2injurymodelgroup,andHSYAgroups.ThecellsinHSYAgroupswerepre-culturedwithdifferentconcentrationsofHSYAfor24h,followedbyadditionof50μmol/LH2O2,andthecellswerethenculturedforanother12h.CellproliferationactivitywasdeterminedbyMTTassay,thecontentofsuperoxidedismutase(SOD)andnitricoxide(NO)wasmeasuredbykits,andtheproteinexpressionlevelsofBax,Bcl-2,Caspase-3,andcleavedCaspase-3weredeterminedbyWesternBlot.ResultsComparedwiththeH2O2modelgroup,HSYAsignificantlyincreasedthecellsurvivalrateinadose-dependentmanner,anditsignificantlyincreasedSODactivity,NOcontent,andBcl-2expressionandsignificantlyreducedtheexpressionofBax,Caspase-3,andcleavedCaspase-3(P<0.01orP<0.05).ConclusionHSYAhasaprotectiveeffectonH2O2-inducedoxidativestressinjuryofvascularendothelialcells,andthemechanismispossiblyrelatedtoinhibitionoftheapoptosisofEC-304cells.(Keywords)hydroxysaffloryellowA;vascularendothelialcell;oxidativestressinjury;apoptosis(收稿日期)2018-10-11(基金项目)北京中医药大学中央高校基本科研业务费专项资金资助（2017-JYB-JS-001）;国家自然科学基金（81673764）。(作者简介)崔丽霞，女，在读硕士研究生，研究方向:植物雌激素药理作用研究。(通讯作者)*陈梦，女，硕士，实验师，E-mail:chenmeng1031@163.com。476湖南中医药大学学报http://qkzzs.hnucm.edu.cn2019年第39卷血管内皮细胞是衬于血管内壁的单层扁平上皮DYY-6C电泳仪（北京市六一仪器厂）;Mini-PRO-细胞，在人体内具有吞噬异物、分泌生长因子、参与TEANTetraCell单垂直电泳槽、Mini-PROTEAN血管形成、调节血管张力、凝血、纤溶等多种生理功Ⅱ转移电泳槽（BIO-RAD公司）。能，保证心血管系统的正常运转。血管内皮细胞损1.2方法伤是造成高血压、动脉粥样硬化等多种心血管疾病1.2.1细胞培养用含10%胎牛血清的1640培养的因素，而氧化应激和细胞凋亡又是导致内皮细胞基，在37℃、5%CO2、100%饱和湿度的培养箱中，静损伤的主要原因[1]，因此，抑制血管内皮细胞免受氧置培养EC-304细胞。传代3次以上，待细胞状态稳化应激损伤，抑制细胞凋亡，保护细胞功能，对于治定后，取对数生长期细胞进行后续实验。疗心血管疾病具有重要临床意义。1.2.2H2O2损伤模型的构建取对数生长期EC-红花是活血通经、祛瘀止痛的中药，羟基红花黄304细胞，用0.25%胰酶消化5min，制成细胞混悬色素A(hydroxysaffloryellowA,HSYA)是红花的主液，以5×103个/孔接种于96孔培养板。待细胞贴壁要活性成分，具有查尔酮类结构，有抗炎、抗肿瘤、治后，吸去培养液，以含H2O2终浓度分别为50、100、疗妇科疾病等多种药理作用，本课题组前期对于200、400、800μmol/L的培养基对细胞进行培养，HSYA的雌激素样作用也进行了相关研究[2]。本实验12h后测定490nm处吸光度值，选取合适的H2O2选取人血管内皮细胞EC-304为研究对象，在体外造模浓度，构建细胞氧化应激损伤模型。用H2O2处理制备氧化应激损伤模型，诱导细胞凋1.2.3MTT法检测细胞增殖活力取对数生长期亡，探讨HSYA对氧化应激损伤细胞的保护作用及EC-304细胞，以5×103个/孔接种于96孔培养板。可能的作用机制。1材料与方法1.1材料待细胞贴壁后，吸去培养液，实验组加入终浓度分别为1×10-5、1×10-6、1×10-7、1×10-8、1×10-9mol/L的HSYA，同时设置正常对照组（无任何处理）和H2O2模型组（50μmol/LH2O2），每组设4个复孔，置于1.1.1细胞株人脐静脉血管内皮细胞株（EC-304）CO2培养箱中，连续培养12、24、36h后，吸弃对照购自南京凯基生物科技发展有限公司。组的培养液，再加入100μL的完全培养基继续作1.1.2药物HSYA购自中国药品生物制品检定用12h。吸弃模型组和各药物组的培养液，加入所，质量分数≥98%，实验时用二甲基亚砜（DMSO）100μL含H2O2终浓度均为50μmol/L的培养基继溶解至所需浓度，4℃保存备用。续作用12h。终止培养，用PBS缓冲液清洗。向各孔1.1.3主要试剂1640培养基（Gibco公司）;胎牛加入MTT100μL，于培养箱中避光孵育4h，吸去血清FBS（Hyclone公司）;0.25%胰蛋白酶（Gibco公上清液，每孔加入DMSO150μL，在摇床上震荡司）;PBS缓冲液（Solarbio公司）;H2O2（Amresco公10min，使紫色结晶完全溶解。用酶标仪测定各组在司）;DMSO（Sigma公司）;四甲基偶氮唑蓝MTT（江490nm处的吸光度值，计算细胞的增殖率。苏凯基生物技术股份有限公司）;SOD试剂盒、NO细胞增殖率=（受试物的平均OD值/对照组的试剂盒（南京建成生物科技有限公司）;一抗:Bax、平均OD值）×100%Bcl-2、Caspase-3、cleavedCaspase-3（Abcam公司）;1.2.4Wst-1法测定细胞SOD含量取对数生长二抗:GoatAnti-RabbitIgG（H+L）（北京普利莱基期EC-304细胞，终止培养，弃培养基，用预冷的因技术有限公司）;蛋白定量试剂盒（北京索莱宝科PBS缓冲液冲洗，加胰酶进行消化，收集细胞混悬液，技有限公司）;ECL化学发光试剂盒（北京普利莱基1000r/min离心5min，吸弃上清液，将离心管置因技术有限公司）;显影液、定影液（天津市世纪奥博于冰上。加入预冷的裂解液（RIPA∶PMSF=100∶1），公司）。不断混匀，待细胞完全裂解后，4℃10000r/min离1.1.4主要仪器VS-1300L-U超净台（日本心5min，吸取上清液。按照说明书，在96孔板中AIRTECH公司）;MC0-18AIC细胞培养箱（日本操作，设置对照组、对照空白组、测定组和测定空白SANYO公司）;TS100普通倒置显微镜（日本NIKON组，其中测定孔与测定空白孔又包括正常对照组、公司）;SAFIREⅡBASIC多功能荧光酶标仪（瑞士模型组和不同浓度HSYA组。置于水平摇床37℃TECAN公司）;3K15低温高速离心机（美国SIGMA孵育20min，酶标仪测定波长为450nm处的吸光公司）;WD-9405B水平摇床（北京六一仪器厂）;度值。第4期崔丽霞，等羟基红花黄色素A对氧化应激损伤血管内皮细胞的保护作用研究477SOD抑制率（%）=（对照组OD值-对照空白组OD值）-（测定组OD值-测定空白组OD值）对照组OD值-对照空白组OD值×100%SOD活力（U/mgprot）=SOD抑制率÷50%×反应体系稀释倍数（0.24mL0.02mL）÷待测样本蛋白浓度1.2.5一步法测定细胞NO含量取对数生长期至更高剂量的H2O2对细胞抑制率过大，易产生细胞毒EC-304细胞，收集细胞混悬液，1000r/min离心性（如图1所示），因此，选择50μmol/L的H2O2作用5min，弃上清液，留细胞沉淀，用PBS缓冲液清洗212h作为EC-304细胞的氧化应激损伤造模条件。表1H2O2对EC-304细胞活力的影响(x±s，n=6)组别OD抑制率/%正常对照组0.4762±0.017950μmol/LH2O2组0.2418±0.0281**清液（匀浆液300μL加试剂一200μL，涡旋充分100μmol/LH2O2组0.1319±0.0180**混匀后静置10min，4000r/min离心15min，吸上200μmol/LH2O2组0.0602±0.0052**次，加入200μLPBS缓冲液，冰水浴条件下超声破碎，制备好匀浆液。在96孔板中操作，设置空白孔、标准孔、测定孔，空白孔加入双蒸水，标准孔加入亚硝酸钠标准液，测定孔中加入各组经处理的细胞上清），分别加入显色剂反应，静置15min，酶标仪测定550nm波长处的各孔吸光度值。NO含量（μmol/L）=测定OD值-空白OD值标准OD值-空白OD值×标准品浓度（20μmol/L）×稀释倍数1.2.6WesternBlot检测细胞蛋白表达取对数生长期细胞，终止培养，弃培养基，用预冷的PBS冲洗，加胰酶进行消化，收集细胞混悬液，1000r/min离心5min，吸弃上清液，将离心管置于冰上。加入预冷的蛋白裂解液，不断混匀，待细胞完全裂解后，4℃10000r/min离心5min，吸取上清液。按照BCA蛋白定量试剂盒说明书检测蛋白含量。用上样缓冲液调节蛋白样品，加热变性后，迅速入冰冷却。配制10%的分离胶和5%的浓缩胶，80V恒压电泳1h，待条带跑至浓缩胶与分离胶的交界处时，电压换为120V。120V恒压湿法转膜75min，室温下封闭1h。加入一抗（β-actin1∶15000，Bax1∶1000，Bcl-21∶2000，Caspase-31∶5000，cleavedCaspase-31∶3000）后于4℃冰箱中过夜，次日洗去一抗，孵育二抗（二抗1∶5000），滴加ECL发光液后显影定影。用ImageJ软件分析结果。1.2.7统计学分析实验数据采用SPSS20.0统计软件进行分析，先对数据进行正态分析及方差齐性检验，符合正态分布和方差齐，采用单因素方差分析ANOVA检验，组间比较用LSD（L）;不符合正态分布和方差齐的，用非参数检验。数据均用“x±s”表示，P<0.05为差异有统计学意义。2结果049.272.387.487.488.0CF400μmol/LH2O2组0.0595±0.0066**800μmol/LH2O2组0.0570±0.0057**注:与正常对照组比较，**P<0.01ADBE注:A.正常对照组;B.50μmol/LH2O2组;C.100μmol/LH2O2组;D.200μmol/LH2O2组;E.400μmol/LH2O2组;F.800μmol/LH2O2组图1显微镜下EC-304细胞形态图（×400）2.2HSYA对细胞增殖活力的影响如表2所示，在24h时，与对照组相比，模型组中细胞增殖率显著下降（P<0.01）;与模型组相比，各药物组细胞增殖率均显著提高（P<0.01），且HSYA浓度越高，效果越显著，呈剂量依赖性。在12h和36h时，与模型组相比，高浓度的HSYA（1×10-5mol/L）促进细胞增殖作用最显著（P<0.01），HSYA（1×10-6、1×10-7mol/L）对细胞也有促进作用（P<0.05）。2.3HSYA对细胞SOD含量的影响如表3所示，与正常对照组相比，模型组SOD含量明显低于正常组，差异有统计学意义(P<0.01)。与模型组相比，HSYA浓度为1×10-5mol/L时，SOD含量明显高于模型组，且差异有统计学意义（P<0.01）。2.4HSYA对细胞内NO含量的影响如表4所示，与正常组相比，模型组中NO的含2.1H2O2对细胞活力的影响量明显低于正常组，差异有统计学意义（P<0.01）。与如表1所示，与正常对照组相比，50μmol/L的模型组比较，HSYA浓度为1×10-5mol/L时，NO的含H2O2可显著抑制细胞增殖（P<0.01）。由于100μmol/L量明显高于模型组，且差异有统计学意义（P<0.01）。478湖南中医药大学学报http://qkzzs.hnucm.edu.cn2019年第39卷表2HSYA对H2O2诱导的EC-304细胞增殖率的影响(x±s，n=4)12h24h36hOD增殖率/%OD增殖率/%OD增殖率/%组别正常对照组模型组0.6080±0.03320.3635±0.0087##1×10-5mol/LHSYA组0.4234±0.0301**1×10-6mol/LHSYA组0.4111±0.0188*1×10-7mol/LHSYA组0.4097±0.0443*1×10-8mol/LHSYA组0.3849±0.01881×10-9mol/LHSYA组0.3647±0.023510059.869.667.667.463.360.00.7668±0.00890.4190±0.0208##0.6471±0.0335**0.5740±0.0330**0.5577±0.0394**0.5245±0.0485**0.5035±0.0395**10054.684.474.972.768.465.70.5410±0.02900.2618±0.0186##0.3829±0.0391**0.3571±0.0254*0.3321±0.0559*0.3108±0.06180.2778±0.022910048.470.866.061.457.451.4注:与正常对照组比较，##P<0.01;与模型组比较,*P<0.05，**P<0.01表3HSYA对EC-304细胞SOD含量的影响(x±s，n=3)2.5HSYA对细胞蛋白表达水平的影响组别正常对照组模型组1×10-5mol/LHSYA组1×10-6mol/LHSYA组1×10-7mol/LHSYA组SOD/(U·mgprot-1)51.55±4.5334.90±1.93##48.64±2.02**41.28±1.3438.92±1.57如图2-3所示，加入HSYA预处理后，与模型组相比，Bax的表达量和Bax/Bcl-2的比值显著降低（P<0.01），Bcl-2的表达量显著升高（P<0.01），且HSYA剂量越高，效果越明显，呈剂量依赖性。药物组与模型组相比，Caspase-3和cleavedCaspase-3的表达含量显著降低（P<0.01），且HSYA剂量越高，效果越注:与正常对照组比较，##P<0.01;与模型组比较,**P<0.01明显，呈剂量依赖性。12345表4HSYA对EC-304细胞NO含量的影响(x±s，n=3)组别正常对照组模型组NO/(μmol·g-1)0.4739±0.03370.3232±0.0093##1×10-5mol/LHSYA组0.4570±0.0568**1×10-6mol/LHSYA组1×10-7mol/LHSYA组0.3864±0.01970.3634±0.0251注:与正常对照组比较，##P<0.01;与模型组比较,**P<0.01BaxBcl-2cleavedCaspase-3Caspase-3β-Actin注:1.正常对照组;2.H2O2模型组;3.1×10-5mol/LHSYA;4.1×10-6mol/LHSYA组;5.1×10-7mol/LHSYA组图2HSYA对EC-304细胞相关凋亡蛋白表达的影响ABCDE注:A.Bax/β-Actin;B.Bcl-2/β-Actin;C.Bax/Bcl-2;D.Caspase-3/β-Actin;E.CleavedCaspase-3/β-Actin与正常对照组比较，##P<0.01;与模型组比较,**P<0.01图3HSYA对EC-304细胞Bax、Bcl-2、Caspase-3、cleavedCaspase-3表达的影响(x±s，n=3)第4期崔丽霞，等羟基红花黄色素A对氧化应激损伤血管内皮细胞的保护作用研究4793讨论行研究，结果表明，HSYA可以提高损伤细胞的增殖率，增加细胞内抗氧化酶的活性，抑制细胞凋亡，并且活性氧自由基引起的血管内皮细胞氧化应激损具有剂量依赖性。这一结果为我们深入研究HSYA保伤是诱发多种心血管疾病的病因。H2O2是机体代谢护心血管疾病的作用机制和途径提供了实验基础，为产生的一种氧自由基，血管内皮细胞受到H2O2的刺其临床应用提供了理论依据，奠定了新思路。激后，打破了原本的氧化与抗氧化平衡状态，引起细胞功能障碍，诱发细胞凋亡[3-4]。本实验选取50umol/L参考文献的H2O2作用于EC-304细胞，建立氧化应激损伤模型。预先加入HSYA可以提高细胞的存活率，提高细胞中SOD表达水平及NO的含量，且呈一定的剂量[1]CHENX,PANGS,LINJ,etal.Allicinpreventsoxidizedlow-densitylipoprotein-inducedendothelialcellinjurybyin-hibitingapoptosisandoxidativestresspathway[J].BMCComple-mentary&AlternativeMedicine,2016,16(1):1-6.依赖关系。SOD是机体内抗氧化酶系的主要成员，可[2]陈梦,赵丕文,孙丽萍，等.羟基红花色素A对雌激素效应相关蛋以有效地清除氧自由基，保护细胞免受氧化损伤，其白表达的影响[J].湖南中医药大学学报,2017,37(11):1218-1221.含量越高表明机体的抗氧化能力越强。NO在体内具有广泛生理作用，在血管系统中，它主要由内皮细胞[3]SUIX,DOUL,CHENX,etal.miR-291b-3pmediatedROS-inducedendothelialcelldysfunctionbytargetingHUR[J].Inter-nationalJournalofMolecularMedicine,2018,42(5):2383-2392.释放，可以阻止内皮细胞凋亡，调节平滑肌以调节血[4]NIKEE.Oxidant-specificbiomarkersofoxidativestress.Associ-管张力，减少血小板聚集，防止血栓形成。NO的生成ationwithatherosclerosisandimplicationforantioxidanteffects[J].量减少被认为是血管内皮功能障碍的原因之一[5]。FreeRadicalBiologyAndMidicine,2018,120:425-440.细胞凋亡是指细胞由基因调控的一种自主有序的死亡，是维持机体内环境稳定的方式。其中与细[5]STEINHORNBS,LOSCALZOJ,MICHELT.NitroglycerinandNitricOxide-ARondoofThemesinCardiovascularTherapeutics[J].NewEnglandJournalofMedicine,2015,373(18):277-280.胞凋亡关系最为密切的基因包括Bcl-2、Caspase两[6]YUY,ZHANGX,LIZ,etal.LncRNAHOTAIRsuppresses大家族。Bcl-2蛋白家族是由B淋巴细胞瘤-2基因TNF-αinducedapotosisofnucleuspulposuscellsbyregulatingmiR-（B-celllymphoma-2，Bcl-2）编码而成，包括Bcl-2样促生存亚家族和Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2asso-ciatedXprotein,Bax）样促凋亡亚家族，正常细胞34a/Bcl-2axis[J].Biomedicine&Pharmacotherapy,2018,107:729-737.[7]OSMANAM,NEUMANNS,KUHNHG,etal.Caspaseinhi-bitionimpairedtheneuralstem/progenitorcellresponseafter中这两者处于平衡状态。在细胞凋亡过程中，Bax通corticalischemiainmice[J].Oncotarget,2016,7(3):2239-2248.过与Bcl-2形成异源二聚体，封闭Bcl-2活性，诱[8]KURIYAMAS,TSUJIT,SAKUMAT,etal.PLEKHN1pro-导细胞凋亡[6]。因此Bax与Bcl-2比值是决定细胞凋亡与否的关键因素。Caspase是一类含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶，Caspase蛋白酶家族有11个成motesapoptosisbyenhancingBax-Bakhetro-oligomerizationthroughinteractionwithBidinhumancoloncancer[J].CellDeathDiscovery，2018,4:11.[9]LOPEZJ,TAITSW.Mitochondrialapoptosis:killingcancerusing员，与细胞凋亡密切相关[7]，Caspase依赖的凋亡通路theenemywithin[J].BritishJournalCancer,2015,112(6):957-962.主要包括死亡受体介导的凋亡通路和线粒体介导的[10]JUNGSY,KIMDY,YUNETY,etal.Treadmillexercise凋亡通路[8-9]。死亡受体与配体结合激活Caspase-8，线粒体释放细胞色素C激活Caspase-9，两条通路最终都刺激Caspase级联，激活Caspase-3。活化的天reducesspinalcordinjury-inducedapoptosisbyactivatingtheP13K/Aktpathwayinrats[J].Experimental&TherapeuticMedicine,2014,7(3):587-593.[11]DINGL,WUJP,XUG,etal.Lentiviral-mediatedRNAitar-冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶（cleveadCaspase-3）getingcaspase-3inhibitsapoptosisinducedbyserumdeprivation与Bcl-2结合，抑制其活性，诱导细胞凋亡[10]，因此，Caspase-3在凋亡程序中起到执行者的关键作用[11]。实验结果显示加入HSYA的药物组Bax和Bax/Bcl-2的比值显著降低，Bcl-2的比值显著升高，Caspase-3inratendplatechondrocytesinvitro[J].BrazilianJournalofMedi-cal&BiologicalResearch,2014,47(6):445-451.[12]ZHAOY,SUNH,LIX,etal.HydroxysaffloryellowAatten-uateshighglucose-inducedpancreaticβ-cellsoxidativedamageviainhibitingJNK/c-junsignalingpathway[J].BiochemicalandBio-和cleavedCaspase-3的表达含量显著降低，提示physicalResearchCommunications,2018,505(2):425-440.HSYA可以抑制细胞凋亡，减轻氧化应激损伤。HSYA作为中药红花的主要活性成分，近年来对其抗氧化作用的研究较多[12-13]，但是对其在心血[13]PEIJP,FANLH,NANK,etal.HSYAalleviatessec-ondaryneuronaldeaththroughattenuatingoxidativestress,in-flammatoryresponse,andneuralapoptosisinSDratspinalcordcompressioninjury[J].JournalofNeuroinflammation，2017,14管系统的抗氧化研究并不多。本实验对HSYA保护(1):97.H2O2造成的血管内皮细胞氧化应激损伤的作用进（本文编辑苏维）
